口腔溃疡是一种常见的口腔黏膜疾病，以齿龈、舌体、两颊、上腭等处黏膜出现米粒大小近似圆形或椭圆形的浅表性溃疡为特征，发作时疼痛明显，病程长且易复发，直接影响患者日常生活[1]。临床治疗多采用局部消炎、止痛为主，但治疗效果并不明显[2]，因此寻找有效药物改善口腔溃疡症状具有重要意义。

芡实壳为包被在芡实种仁外层，厚1～2 mm的坚硬外壳[3]。芡实壳中含有丰富的多酚类成分[4,5]，现代药理学研究表明这类成分具有较强的抗氧化能力[6,7]，通过抑制相关氧化酶和有效清除体内过剩的自由基，保护组织免受氧化损伤[8,9]。Rhim[10]报道大豆提取物的多酚具有清除DPPH的能力，且与多酚含量呈显著正相关。张汆等[11,12]通过对芡实壳提取物主要生理活性和化学组成研究，得出芡实壳提取物具有很强的抗氧化活性和一定的抑菌活性且与其含有丰富的多酚物质密切相关。目前，芡实壳的研究主要集中在体外抗氧化活性及抑菌能力的评价[13,14,15,16]，提取物的体内实验及应用研究未见报道。基于氧化损伤是口腔溃疡的主要诱因，本实验从芡实壳不同极性萃取物体外抗氧化活性、对口腔溃疡模型大鼠的治疗作用开展研究，并从调控Keap1/Nrf2/HO-1信号通路角度探索其机制，旨在为芡实壳进一步开发利用提供实验依据。

1、材料和方法

1.1 药品与试剂

芡实壳原料，购于安徽省滁州市天长市铜城镇龙岗社区；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、还原型辅酶Ⅰ（NADH）和抗坏血酸（VC）购于阿拉丁试剂有限公司；氯化硝基四氮唑蓝（NBT）、硫酸亚铁、双氧水、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、戊巴比妥钠购于国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、冰醋酸等试剂均为国产分析纯；福林酚、芦丁、没食子酸（纯度≥98%购自上海源叶生物科技有限公司）。桂林西瓜霜（桂林三金药业股份有限公司），超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒、丙二醛（MDA）测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒和过氧化氢酶（CAT）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；Lamin B1、β-actin、Keap1抗体（成都正能生物技术有限公司）、Nrf2抗体（CST）、HO-1抗体（Abcam）。

1.2 仪器和设备

Multiskan spectrum全波长酶标仪（赛默飞）；XP 26分析天平（十万分之一）（Mettler Toledo);Simplicity-185超纯水仪（Millipore);GZX-9070电热恒温干燥箱（上海博讯公司）。

1.3 实验动物

SPF级雄性SD大鼠共72只，体质量180±20 g，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司[许可证编号：SCXK(鲁)20190003]，大鼠放在昼夜交替、温湿度分别为24±2℃和40%～65%的房间饲养，大鼠正常摄食，饮水，普通饲料饲养。实验动物已获得安徽中医药大学实验动物伦理委员会批准（伦理批号：AHUCM-mouse-2022051）。

1.4 芡实壳总提取物(EST)的制备

干燥芡实壳5 kg，破碎成粉末，用25 L水浸泡1晚，煎煮2次，2 h/次，过滤，合并减压浓缩至棕色浸膏。取制得浸膏的一半，加水分散，依次用等体积乙酸乙酯，正丁醇分别萃取3次，减压回收溶剂，得乙酸乙酯部位浸膏（ESE）、正丁醇部位浸膏(ESN)和水相。所得浸膏于4℃冰箱放置备用，用时加蒸馏水稀释为所需浓度，桂林西瓜霜（PG）用时以蒸馏水配制相应浓度。

1.5 芡实壳不同极性萃取物总酚，总黄酮测定

以没食子酸为标准品，采用福林酚法测定总多酚含量[17]；以芦丁为标准品，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法测定总黄酮含量[18]。

1.6 芡实壳不同极性萃取物体外抗氧化活性测定

芡实壳不同极性萃取物对DPPH[19]、ABTS+·[20]、·OH自由基[21]和超氧阴离子（·O2-)[22]清除实验，以VC作阳性对照，所有实验均设定3个复孔。

1.7 芡实壳不同极性萃取物对口腔溃疡模型大鼠防治作用

1.7.1 动物模型制备

取健康SD雄性大鼠60只，参照陈吉莉等[23]建立的化学灼烧法并稍做优化后造模。用3%戊巴比妥钠溶液按照0.1 mL/100 g腹腔注射麻醉，用无菌棉球干燥SD大鼠下切牙唇侧黏膜，将3 mm×3 mm正方形滤纸片置于50%浓度冰醋酸5 s后取出，立即放置于干燥后的大鼠下切牙唇侧黏膜上，维持30 s后取下滤纸片，用含生理盐水无菌棉球蘸拭处理部位，去除残余醋酸，以此建立大鼠口腔溃疡模型。造模24 h后，观察大鼠造模区局部黏膜的情况，如果形成约为直经约0.5 cm的溃疡，肉眼可见大鼠口唇边潮湿，流口水，且周围有充血、红肿和假膜，则表明溃疡成功形成。

1.7.2 动物分组及给药

造模成功大鼠随机分为5组，即模型组（MG）、阳性药组（PG）、芡实壳提取物实验组（芡实壳总提物组EST、乙酸乙酯组ESE和正丁醇组ESN），每组12只，另取12只健康SD雄性大鼠为正常对照组（CG）。CG和MG以生理盐水1 mL/100 g,1次/d，灌胃；PG以桂林西瓜霜1 g/kg,1次/d，灌胃；药物组（芡实壳总提物组EST、乙酸乙酯组ESE和正丁醇组ESN）以1 g/kg（半数致死量LD50=6.26 g/kg),1次/d，灌胃。每次给药后禁水禁食30 min，连续给药10 d。

1.7.3 大鼠口腔溃疡面积的测定

参照陈卓等[24]方法用游标卡尺测量各组大鼠给药前及给药第3、5、7、9天的口腔溃疡面积。计算：溃疡面积=3.14×d1×d2×1/4(d1,d2分别为溃疡面的最大横径和最大纵径）。平均进食量（g）=每笼饲料消耗量/每笼动物数。

1.7.4 大鼠口腔溃疡黏膜组织病理改变观察

取各组口腔溃疡部位的黏膜组织，以4%多聚甲醛固定，石蜡包埋、固定、脱水后HE染色，进行光镜检查。

1.7.5 大鼠血清中SOD、MDA、GSH-Px、CAT水平检测

给药结束后，戊巴比妥钠麻醉状态下进行腹主动脉采血，血液在室温条件下放置2 h后，用离心机3500 r/min离心15 min，用1.5 mL的离心管将血清分装并做好标记，放于-20℃的冰箱中冻存。取大鼠血清，严格按照相应试剂盒说明书步骤操作，分别测定血清中SOD、MDA、GSH-Px、CAT水平。

1.7.6 大鼠口腔溃疡黏膜组织中Keap 1、Nrf 2、NEs-Nrf 2和HO-1蛋白水平检测

取溃疡粘膜组织，加入含PMSF的RIPA裂解液，研磨器充分研均，冰上裂解30 min，离心后收集上清液为提取的总蛋白，细胞核蛋白提取按照试剂盒说明书进行。BCA法检测蛋白浓度，加入Loading buffer，煮沸变性，-20℃保存。SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白转移至PVDF膜上，5%奶粉封闭2 h，分别加入Keap 1一抗（1∶1000),Nrf 2一抗（1∶1000),HO-1一抗（1∶1000),β-actin一抗（1∶5000),Lamin B一抗（1∶5000)4℃过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，分别加入HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶10 000）和HRP标记的山羊抗鼠IgG(1∶10 000），室温孵育2 h,TBST洗膜3次，10 min/次。避光条件下滴加ECL化学发光试剂进行显影。采用Image J软件分析各条带的灰度值，计算蛋白相对表达量。

1.8 统计学方法

采用GraphPad prism 8.0、SPSS 23.0软件对数据进行统计分析，计量数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-T检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 总多酚、总黄酮分析

由没食子酸标准曲线计算得出芡实壳不同极性萃取物总多酚含量，其中ESE含量最高为313.92±32.28 mg/g，各萃取物中总酚含量依次为ESE>ESN>EST。由芦丁标准曲线计算得出芡实壳萃取物总黄酮含量，ESE含量最高为23.43±0.61 mg/g，各萃取物中总黄酮含量依次为ESE>ESN>EST（表1）。

表1 芡实壳萃取物总多酚和总黄酮含量 

2.2 芡实壳不同极性萃取物体外抗氧化活性分析

2.2.1 DPPH自由基的清除能力

芡实壳不同极性萃取物与Vc均具有DPPH自由基清除能力，在2～10µg/mL浓度范围内有一定的浓度依赖性。在芡实壳不同极性萃取物浓度为10µg/mL时，ESE,ESN,EST的清除率分别是87.55%,95.09%,67.84%，均高于阳性对照Vc的清除率60.99%。ESE的IC50值最小，为3.42µg/mL，说明芡实壳不同极性萃取物清除DPPH自由基的活性成分主要在ESE中（表2）。  

表2 芡实壳萃取物和VC的IC50值  

2.2.2 ABTS+·自由基的清除能力

实验结果提示，芡实壳不同极性萃取物与Vc对ABTS+·自由基具有一定清除能力，在2～10µg/mL浓度范围内，随着浓度的增加，清除能力不断增强。在样品浓度10µg/mL时，ESE,ESN,EST和Vc的清除率依次为：97.10%,76.11%,78.84%和55.52%。ESE的IC50值最小，为3.34µg/mL，说明芡实壳不同极性萃取物清除ABTS+·自由基的活性成分主要在ESE中（表2）。

2.2.3·OH的清除能力

芡实壳不同极性萃取物与Vc对·OH具有一定清除能力，在100～1000µg/mL浓度范围内，·OH清除率随着浓度的增加而增强。在样品浓度为1000µg/mL时，Vc的清除率为92.88%,ESE,ESN,EST的清除率依次为67.70%,42.60%,53.90%。芡实壳不同极性萃取物与Vc清除·OH的IC50由大到小为Vc(310.7µg/mL)>ESE(351.9µg/mL)>EST(670.4µg/mL)>ESN(891.6µg/mL），因此芡实壳不同极性萃取物清除·OH自由基的活性成分同主要在ESE中（表2）。

2.2.4·O2-的清除能力

在20～100µg/mL浓度内，芡实壳不同极性萃取物与Vc对·O2-自由基清除率随着浓度的增加而增加。ESE,ESN,EST和Vc的IC50值依次为：54.66µg/mL,42.64µg/mL,44.98µg/mL和46.09µg/mL，因此芡实壳不同极性萃取物对·O2-自由基均有一定的清除能力（表2）。

2.3 对口腔溃疡模型大鼠治疗作用

2.3.1对口腔溃疡模型大鼠整体活动的影响

大鼠口腔溃疡采用化学灼伤法造模，24 h后，正常组大鼠反应灵敏，背毛光泽，活动正常。造模组大鼠懒动，反应迟钝，弓背竖毛，下唇肿胀。

2.3.2对口腔溃疡模型大鼠体质量及进食量的影响

实验期间，各组大鼠体质量与进食量均有增长，其中MG大鼠与CG和各给药组相比，略有减少，但差异无统计学意义（P>0.05),50%醋酸灼伤诱导的口腔溃疡对大鼠体质量与进食量有一定影响，给药后影响减小（图1）。

图1 芡实壳萃取物对大鼠体质量和进食量的影响   

2.3.3对口腔溃疡模型大鼠溃疡面积的影响

造模24 h后，CG大鼠口腔黏膜表面光滑，无炎性水肿现象。MG大鼠造模区域呈凹陷型缺损，凹陷周围组织红肿，表面有黄白色假膜覆盖。给药第3天，MG与各给药组大鼠下唇肿胀，溃疡面假膜加厚，MG与各给药组大鼠溃疡面无显著性差异（P>0.05）。给药第5天，MG可见下唇肿胀，口腔溃疡创面明显，周围组织炎性水肿和充血明显；PG与ESE组假膜变薄，炎性水肿和充血减轻，溃疡面积减小，与MG比较，差异有统计学意义（P<0.05);PG与ESE比较，差异无统计学意义（P>0.05）。给药第7天，MG和各给药组大鼠症状均减轻。其中PG和ESE，溃疡创面假膜褪去，无炎性水肿和充血，溃疡面明显减小，与MG比较，差异有统计学意义（P<0.05);ESE与PG比较，差异无统计学意义（P>0.05),ESN和EST溃疡面较MG无明显变化。给药第9天，PG和ESE大鼠溃疡面平整，无炎性水肿，无充血，溃疡面接近愈合，与MG比较，差异有统计学意义（ESE组P<0.01,PG组P<0.001);PG与ESE比较，差异无统计学意义（P>0.05）。MG大鼠溃疡面可见炎性水肿，无充血。其中EST和ESN与MG相比症状略有减轻（图2）。

2.3.4对口腔溃疡模型大鼠口腔黏膜组织病理改变的影响

CG：可见大鼠口腔黏膜上皮完整，下部为疏松结缔2.3.1对口腔溃疡模型大鼠整体活动的影响大鼠口腔溃疡采用化学灼伤法造模，24 h后，正常组大鼠反应灵敏，背毛光泽，活动正常。造模组大鼠懒动，反应迟钝，弓背竖毛，下唇肿胀。组织，细胞排列有序，无血管性出血和炎性细胞浸润等病理改变。MG与CG相比，口腔黏膜破坏严重，鳞状上皮缺失，表面布满坏死组织，大面积炎性细胞浸润和血管性出血。各给药组经过10 d的药物治疗，与MG相比，大鼠口腔黏膜均恢复较完整的角化层和鳞状上皮，少量炎性细胞浸润，无血管性出血。其中，PG和ESE角化层较薄，基底层基本恢复。

相较于MG:PG、EST、ESE和ESN对冰醋酸诱导的大鼠口腔溃疡均有促进愈合作用，其中PG和ESE促进愈合效果最快，其次是EST和ESN（图3）。

2.3.5 对口腔溃疡模型大鼠血清中GSH-Px、MDA、SOD和CAT水平的影响

与CG相比，MG大鼠血清中CAT水平明显降低，MDA水平有明显升高，差异均具有统计学意义（P<0.01）。与MG相比，PG和ESE MDA水平显著降低（P<0.01);PG和ESE CAT水平显著升高（P<0.01);ESE与PG相比无显著性差异（P>0.05，图4）。2.3.6对口腔溃疡模型大鼠口腔黏膜组织中Keap1、Nrf2、NEs-Nrf2和HO-1蛋白表达水平的影响与CG比，MG Keap1蛋白表达明显升高（P<0.05),Nrf2蛋白表达量显著降低（P<0.01）、NEs-Nrf2以及HO-1蛋白表达降低，差异不具有统计学意义；与MG比，ESE组Keap1蛋白表达量显著降低（P<0.01),Nrf2蛋白表达量显著升高（P<0.01),NEs-Nrf2以及HO-1蛋白表达明显升高（P<0.05）；相较于PG,ESE组Keap1表达量降低，Nrf2、NEs-Nrf2以及HO-1蛋白表达量有所增加，但差异均无统计学意义（P>0.05，图5）。

图2 芡实壳萃取物对大鼠口腔溃疡面积的影响  

图3 大鼠口腔黏膜HE染色  

图4 芡实壳萃取物对大鼠血清中GSH-Px、MDA、SOD和CAT水平的影响  

3、讨论

口腔溃疡是口腔黏膜疾病中发病率最高的一种疾病，发病时疼痛明显，严重影响患者正常生活，工作和学习，其致病因素包括创伤、免疫失常、口腔菌群失调、微量元素、维生素缺乏和氧化应激。近年来氧化应激被认为是口腔溃疡发生的主要原因[25,26]。氧化应激发生时，机体中氧自由基产生增加或清除能力降低引发活性氧（ROS）蓄积，从而引起氧化损伤[27,28]。研究表明，口腔溃疡发生时，血清中抗氧化酶活性降低，丙二醛（MDA）水平显著升高，提高抗氧化酶活力能够清除过剩自由基降低口腔黏膜炎的发生率并提高创面闭合率[29,30,31]。本研究结果表明芡实壳不同极性萃取物可有效清除DPPH·、ABTS+·、·OH和·O2-自由基，具有一定的体外抗氧化活性；在通过冰醋酸灼伤法建立的口腔溃疡大鼠模型中检测到模型组大鼠血清CAT活力明显下降，MDA含量显著升高，表明冰醋酸灼伤法造成了大鼠口腔溃疡氧化损伤，给与西瓜霜和芡实壳萃取物治疗则降低了大鼠血清中MDA水平、提高了血清中SOD、GSH和CAT等抗氧化酶活力，提示芡实壳萃取物可缓解大鼠口腔溃疡氧化应激损伤。

Nrf2/Keap1-ARE信号通路在维持细胞氧化平衡，细胞增殖及炎症的调节过程中发挥重要作用，是目前研究机体氧化应激防御的主要通路[32,33]。正常生理状况下，Nrf2与Keap1以二聚体的形式存在并因泛素化被蛋白酶迅速降解，氧化应激时，Nrf2与Keap1解离，游离的Nrf2转移入核并结合抗氧化元件ARE，激活下游抗氧化酶HO-1、SOD、GSH-Px、CAT等的表达，从而抑制氧化反应[34,35]；因此调节Nrf2/Keap1-ARE信号通路相关酶及蛋白表达，对细胞氧化应激损伤具有一定的保护作用[36]。研究表明，大麻二酚（CBD）能够通过降低Keap1水平，增加Nrf2水平和核转位来预防5-氟尿嘧啶诱导人口腔角质细胞产生的口腔黏膜炎[37]。葛根芩连汤，银杏叶滴丸可通过激活溃疡组织内Nrf2/Keap1-ARE通路抑制氧化应激反应和促进大鼠口腔溃疡愈合[38,39]。本研究结果表明，冰醋酸灼伤后的模型组大鼠溃疡黏膜Keap1蛋白表达明显高于正常组，Nrf2、NEs-Nrf2以及HO-1蛋白表达明显低于正常组。给与芡实壳萃取物后，大鼠溃疡黏膜Keap1蛋白表达量降低，Nrf2、NEsNrf2以及HO-1蛋白表达升高，表明芡实壳萃取物可通过激活Keap1/Nrf2/HO-1信号通路改善大鼠口腔溃疡。

综上，本研究结果表明芡实壳不同极性萃取物均具有较好的抗氧化作用，采用冰醋酸灼伤法建立口腔溃疡大鼠模型验证了芡实壳萃取物具有一定的抗口腔溃疡作用。激活Keap1/Nrf2/HO-1信号通路，提高下游CAT,HO-1等抗氧化酶活性可能是其发挥作用的主要机制。本研究旨在为临床上芡实壳用于抗氧化、治疗口腔溃疡相关药物的开发提供实验依据。

图5 口腔溃疡模型大鼠口腔黏膜组织中Keap1、Nrf2、NEs-Nrf2和HO-1蛋白水平 

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基金资助:省部共建安徽道地中药材品质提升协同创新中心(教科信厅函[2022]4号);

文章来源:王琼,许凤清,邓梦云,等.芡实壳提取物的抗氧化活性及对口腔溃疡模型大鼠的治疗作用[J].南方医科大学学报,2024,44(04):787-794.