慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)进展至肾衰竭的最常见病理表现是肾脏纤维化，其特征为肾小球硬化、肾小管萎缩和肾间质纤维化[1,2]。由于缺乏靶向治疗来延缓肾纤维化，患有CKD的患者常面临着不良的预后和沉重的经济负担。其中，肾小管上皮细胞的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是触发肾纤维化形成的关键机制，然而目前临床上尚缺乏特异性生物标志物和有效治疗靶点。因此积极寻找调控肾小管上皮细胞EMT发生的关键靶分子，对于进一步揭示肾纤维化病理机制尤显重要[3,4]。

HES5(hairy and enhancer of split 5)是碱性-螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix, bHLH)超家族成员，作为一个重要转录因子广泛参与了细胞分化、凋亡、增殖乃至肿瘤发生等生理病理过程[5,6,7]。前期研究对于HES5的关注点主要集中在神经分化和恶性肿瘤，而最近的研究开始聚焦在肾脏领域。研究发现，注射丹参芍药散血清可以抑制Notch信号通路，治疗组的Jagged1、Notch1、HES5、NICD、α-SMA和Vimentin的蛋白和mRNA水平显著降低，从而改善肾小管细胞上皮-间充质转化[8]。另有研究显示：在小鼠的单侧输尿管梗阻模型中，HES5的mRNA表达上调，同时伴随着 IL-22 的上调；而HES5在正常小鼠的肝脏和肾脏中的表达较低[9]。一系列研究证实，Notch信号通路促进肾纤维化的进展[10,11]。而HES5是Notch通路的下游靶基因，其参与多种肾脏疾病，但在肾纤维化中的作用及机制尚不清楚。

EMT是一个动态而复杂的过程，包括TGF-β信号通路、Wnt信号通路、RAAS信号通路和Notch信号通路参与[11,12,13]。除此，磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKT)信号通路的激活也是发生EMT的一个关键驱动因素[14,15]。研究证实，TGF-β1可以激活PI3K,导致其下游效应分子AKT发生磷酸化，从而激活肾间质纤维化进展[16,17]。综上所述，本研究主要通过建立肾小管上皮-间质转化模型， 探究HES5是否参与肾小管上皮细胞转分化和细胞凋亡；进一步探讨敲低HES5抑制肾小管上皮细胞发生EMT的机制是否与PI3K/AKT信号通路有关。

1、材料与方法

1.1 差异表达基因的筛选

从基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus, GEO)下载序列号为GSE66494的基因表达谱。GSE66494数据包括正常肾活检组织样本(8个)和CKD患者肾活检组织样本(53个)。以|log2FC|≥1和P<0.05作为筛选标准选出差异表达基因 (differentially expressed gene, DEG)后，利用R语言，借助ggplot2绘制火山图，并且注释出NOTCH信号通路下游的靶基因。

1.2 输尿管梗阻模型(unilateral uretera obstruction, UUO)建立

16只8周龄雄性 C57BL/6 背景野生型小鼠，体质量20～23 g, 购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，饲养于陆军军医大学免疫学研究所的层流动物房，恒温、恒湿条件下自由饮水，实验方案由陆军军医大学实验动物福利伦理委员会批准(AMUWEC20210702)。实验分组如下： 假手术组(Sham组)、手术组(UUO组),每组8只。建立小鼠UUO模型，即给予 1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉之后，取腹部正中1 cm切口，逐层分离至左侧肾脏及输尿管，充分暴露输尿管，6-0丝线结扎后自中间剪断输尿管，观察无明显出血后关闭腹腔。假手术组仅分离输尿管，不结扎剪断，其余步骤同手术组。保温毯上复苏小鼠后，分笼饲养并每日观察小鼠状态。14 d后，收集小鼠左侧肾脏用于下一步实验。

1.3 肾小管上皮-间质转化模型的构建

HK-2细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司) 在37 ℃、5%CO2的孵箱中培养，2～3 d 换液 1 次。当细胞铺板后达到约70%密度时，将HK-2细胞饥饿24 h, 接着用终浓度为0、5、10、15 ng/mL TGF-β1(武汉爱博泰克生物科技有限公司)分别处理24 h或者用终浓度为10 ng/mL TGF-β1分别刺激0、24、48、72 h。最后，使用倒置显微镜(日本尼康公司)观察细胞的形态和Western blot检测纤连蛋白(Fibronectin, FN)、胶原蛋白Ⅰ(Collagen Ⅰ)和波形蛋白(Vimentin)蛋白。

1.4 质粒及siRNA设计

通过qRT-PCR扩增合成HES5的编码序列，并克隆到T载体质粒上。T-HES5构建体后，T-HES5和pcDNA3.1+经BamHⅠ和EcoRⅠ双重酶切。将靶标HES5片段和pcDNA3.1+骨架连接起来，随后转入大肠杆菌感受态细胞。选择单克隆菌落后，鉴定重组的pcDNA3.1-HES5构建体，并由上海生物工程公司测序。

根据人HES5信使RNA(mRNA)序列设计了3种HES5特异性siRNA,并由上海生物工程公司合成。这些靶向序列如下：HES5-207:CGAGCAGCUGAAGCUG-CUGCUTT;HES5-354:CCAGGACUACAGCGAAGGCU-ATT和HES5-420:CGCCAGCGACACGCAGAUGAATT。设置Control组、siNC组、siHES5-3组、siHES5-2组、siHES5-1组，运用qRT-PCR和Western blot鉴定最有效的siRNA。一种无关的双链RNA,UUCUCCGAACG-UGUCACGUTT被用作阴性对照。

1.5 瞬时转染

当HK-2细胞达到70%～80%汇合率时，通过Lipofectamine 3000(Invitrogen, 美国)以转染指定的质粒或小干扰RNA(siRNA)。用 pcDNA 3.1-HES5转染HK-2细胞48 h构建过表达模型，设置对照组(Control组)、空载组(Vector组)、HES5组(HES5质粒转染组);用HES5 siRNA敲低处理HK-2细胞24 h后，使用在浓度为10 ng/mL TGF-β1的培养基或者普通培养基继续诱导其24 h, 设置Control组、siHES5组、TGF-β1组、siHES5+TGF-β1组(TGF-β1 诱导转染 HES5 siRNA 的 HK-2 细胞组),以备后续实验。

1.6 RNA分离和qRT-PCR检测

借助TRIzol 试剂盒(Invitrogen, 美国)提取各组HK-2细胞的总RNA,然后参考制造商的方案，逆转录为cDNA 后进行扩增，通过比较循环阈值并以β-tubulin作为内参计算，检测各组细胞中 HES5的mRNA相对表达水平。HES5上游引物：5′-ACCGCATCAACAG-CAGCATT-3′,下游引物：5′-AGGCTTTGCTGTGCTTCA-GGT-3′;β-tubulin上游引物：5′-ATCCAGAGCAGGGA-AAGCTG-3′,下游引物：5′-CTCAGGCCGTTGTTCTA-GGG-3′。

1.7 蛋白质印迹分析

使用含磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液(Thermo Fisher Scientific, 美国)提取细胞总蛋白，并测定浓度后保存。将蛋白样品依次进行电泳、转膜、封闭后，分别予以一抗HES5(中国ABclonal, 1∶500)、Bax(美国CST,1∶1 000)、Bcl2(美国CST,1∶1 000)、Fibronectin(美国Bioworld, 1∶1 000)、Vimentin(美国Bioworld, 1∶3 000)、Collagen Ⅰ(美国CST,1∶1 000)、p-PI3K(中国 Bioss, 1∶1 000)、PI3K(中国Bioss, 1∶1 000)、p-AKT(中国Bioss, 1∶1 000)、AKT(中国 Bioss, 1∶1 000)、β-tubulin(美国 Bioworld, 1∶3 000)。在4 ℃下过夜。次日复温、洗涤后，孵育二抗，显影。最后，将各条带灰度值直接与内参β-tubulin相比，并将3次独立实验所得结果进行统计分析。

1.8 免疫荧光及TUNEL检测

在6孔板里制备细胞爬片，转染或加药处理一定时间后，用4%甲醛固定细胞30 min后透化、封闭、一抗过夜。次日，将细胞与Cy3/Dylight488偶联的二抗(Biolegend, 美国)避光孵育1 h。最后，用Hoechst 33258(Beyotime, 中国)对细胞核进行共染色，并使用荧光显微镜(奥林巴斯，日本)观察并采集图像。

用4%甲醛固定制备的细胞爬片30 min, 然后根据制造商(Beyotime, 中国)的说明进行TUNEL测定。最后，通过荧光显微镜观察并采集图像。

1.9 流式细胞仪检测细胞凋亡率

根据需求处理各组实验细胞，用0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)处理后，利用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(BestBio, 中国)及流式细胞仪( BD,美国) 检测凋亡的HK-2细胞。

1.10 统计学分析

所有实验按3 次独立实验进行，应用 GraphPad Prism 8.0 进行数据分析，计量资料以

表示。组间比较采用非配对t 检验。P<0.05 认为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 HES5在慢性肾脏病中的差异性表达

根据GSE66494芯片的分析结果绘制成火山图 (图1)。在GSE66494数据集中注释出Notch通路的一系列下游靶基因：HES1、HES4、HES5、HES6、HES7、HEYL、HEY2。不难发现，其中HES5是在CKD中显著上调的差异性基因(P<0.05)。并且，在小鼠的UUO模型中也得到相似的结论：与Sham组相比，HES5在纤维化的肾组织中表达明显增加(图2)。

2.2 HES5在TGF-β1处理的HK-2细胞中表达显著上调

HK-2细胞在终浓度为0、5、10、15 ng/mL的TGF-β1刺激24 h后，纤连蛋白(Fibronectin, FN)、胶原蛋白Ⅰ(Collagen Ⅰ)和波形蛋白(Vimentin)均以剂量依赖性方式上调(图3A),结果显示10 ng/mL TGF-β1能明显诱导HK-2细胞的转分化。因此，本研究以10 ng/mL TGF-β1分别处理HK-2细胞0、24、48、72 h, 其中24 h组显示3种纤维化相关因子的表达上调均具有统计学意义(P<0.05,图3B)。综合考虑，选用10 ng/mL TGF-β1处理HK-2细胞24 h作为后续实验建立体外肾纤维化模型的条件。

本研究首先运用qRT-PCR和Western blot检测TGF-β1(10 ng/mL)处理HK-2细胞24 h后HES5的表达，结果显示：TGF-β1处理后，HES5在基因和蛋白水平的表达均显著上调(P<0.05,图4A)。除此，研究发现TGF-β1 以时间和剂量依赖性方式诱导HES5 的蛋白表达(图4B、C)。以上结果表明，HES5在TGF-β1诱导的HK-2细胞中表达显著上调。不难发现，HK-2细胞的成纤维细胞样改变越明显，HES5表达越高，结果提示两者可能存在着某种联系。

图1 GSE66494中DEG的火山图

图2 HES5 高表达于 UUO 诱导的小鼠纤维化肾组织中

图3 TGF-β1 诱导肾小管上皮细胞发生 EMT

图4 TGF-β1诱导的HK-2细胞中HES5表达的情况

2.3 过表达HES5 促进肾小管上皮细胞转分化和凋亡

为了验证这一推测，本研究将含有HES5的质粒瞬时转染到HK-2细胞中。首先，通过Western blot和qRT-PCR验证质粒构建的有效性，结果显示：在转染 pcDNA3.1-HES5的HK-2细胞中，HES5 蛋白表达量高于对照组(Control组)和空载体组(Vector组),并具有统计学意义；与 Control及Vector组相比， HES5组mRNA 表达量明显升高(P<0.05,图5A),以上结果均说明成功构建了过表达HES5的HK-2细胞模型。其次，本研究运用Western blot评估了每组FN、Collagen Ⅰ、Vimentin的表达水平。结果显示：HES5组的FN、Collagen Ⅰ、Vimentin的蛋白表达与Control组相比明显增加(P<0.05,图5B)。此外，与Control组相比，HES5过表达组显示出Bax表达的增加和Bcl2表达的减少，结果具有统计学意义(P<0.05,图6A)。通过TUNEL进一步验证，HES5组的细胞凋亡与Control组相比明显增加(图6B)。以上结果证实，过表达HES5 触发了肾小管上皮-间质转化和细胞凋亡的开关。

2.4 敲低 HES5减轻了TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化和凋亡

为了进一步验证HES5在肾纤维化中的作用，本研究通过Western blot和qRT-PCR筛选最有效的干扰序列，结果显示：并非所有 HES5 siRNA 均能有效地抑制 HES5 蛋白的表达，相较于其他2组HES5的干扰序列，HES5 siRNA-1 的抑制效果最佳(P<0.05),其抑制率约为 50%(图7A)。通过Western blot检测证实，与TGF-β1刺激野生型HK-2细胞相比，用TGF-β1刺激HES5敲低的HK-2细胞，其FN、Collagen Ⅰ、Vimentin的表达均下调(图7B)。免疫荧光检测得出了一致的结论(图7C)。另外，Western blot和流式细胞术的结果表明，HES5基因的敲低削弱了TGF-β1诱导的HK-2细胞凋亡(P<0.05,图8)。以上实验结果证实，敲低HES5可以在体外显著抑制肾小管上皮-间质转化和细胞凋亡。

2.5 调控 HES5对TGF-β1激活的PI3K/AKT信号通路的影响

本研究在细胞层面进一步探讨HES5调控上皮-间质转分化的信号机制。由于 PI3K/AKT 信号通路与肾纤维化的发展过程密切相关，因此对PI3K/AKT信号通路相关指标的表达进行检测。Western blot检测结果显示，与 TGF-β1组比较，用TGF-β1刺激HES5敲低组的p-PI3K、p-AKT 蛋白表达量明显减少(P<0.05),提示HES5基因敲低使 TGF-β1 诱导的HK-2细胞内PI3K/AKT信号通路的激活程度降低(图9)。通过加入PI3K抑制剂后，Vimentin的表达较单纯HES5组明显降低(图10),说明PI3K/AKT信号通路可能与肾小管上皮-间质转化有关。

图5 过表达HES5诱导肾小管上皮细胞发生EMT

图6 过表达HES5诱导肾小管上皮细胞凋亡

图7 敲低HES5对TGF-β1诱导肾小管上皮细胞发生EMT的影响

图8 敲低HES5对TGF-β1诱导肾小管上皮细胞凋亡影响

图9 敲低HES5对TGF-β1激活的PI3K/AKT信号通路的影响

图10 PI3K/AKT信号通路抑制剂对HES5诱导的Vimentin影响

3、讨论

慢性肾脏病定义为各种原因引起的肾脏结构或功能损害(≥3个月),具有病程长、预后差、并发症多及经济负担重等特点，迄今由于缺乏有效治疗手段而面临严峻挑战[2]。肾脏纤维化是慢性肾病的共性，与疾病的进展密切相关。最近的一些重要进展已经阐明了上皮-间质转化(EMT)在肾纤维化背后的核心地位，可作为一种延缓肾纤维化的潜在治疗靶标[3,4]。因此，探索调控肾小管上皮细胞EMT发生的核心靶分子，对于防治慢性肾脏病，延缓肾纤维化进展具有重要临床意义。

既往研究证实，Notch信号通路参与IgA肾病、糖尿病肾病、高血压肾病的肾纤维化进程，而HES5作为Notch通路下游的靶基因是否参与肾纤维化尚无定论[13,18,19]。本研究首先借助基因的差异性和UUO模型分析得出：HES5的表达在CKD和小鼠纤维化肾组织中均显著上调，这与以往研究结论相似[8,9]。接着，研究发现TGF-β1以剂量依赖性和时间依赖性的方式上调HES5的蛋白表达，HES5表达的增加伴随着FN、Collagen Ⅰ、Vimentin等促纤维化指标的表达增加，故本研究通过建立过表达或敲低HES5的细胞模型来进一步探讨HES5在肾小管EMT中的作用。研究发现，HES5过表达可以促进肾小管上皮细胞EMT的进展，体现在与野生型HK-2细胞相比，质粒组的HK-2细胞中FN、Collagen Ⅰ、Vimentin表达较高。此外，敲低HES5显著抑制TGF-β1诱导HK-2细胞发生EMT,降低了FN、Collagen Ⅰ、Vimentin的表达。这些结果进一步支持HES5参与了EMT的发生发展且可以独立于TGF-β1发挥作用。

除此，HES5 已被报道参与多种细胞的凋亡过程，如精原细胞、肝细胞、肠上皮细胞、神经元等[20,21,22]。有研究表明，在非酒精性脂肪性肝病中HES5抑制的LIGHT转录可能有助于肝细胞凋亡[20];而在高同型半胱氨酸血症中可以通过下调HES1和HES5表达来诱导嗅球神经元的凋亡[21]。本研究利用基因转染技术调控HES5的表达，借助Western blot、TUNEL及流式细胞术等实验技术探究HES5对肾小管上皮细胞凋亡的调控作用。实验发现质粒组的HK-2细胞中Bax蛋白增加和Bcl2蛋白减少；流式细胞术结果提示敲低HES5表达降低了TGF-β1诱导HK-2细胞凋亡率。肾间质炎症反应、肾小管上皮细胞凋亡和进行性纤维化是慢性肾损伤的主要表现，其中细胞凋亡与肾纤维化关系密切[23]。大量研究证实，抑制或逆转细胞凋亡可延缓肾纤维化的进程，改善CKD患者的预后，提示细胞凋亡在肾纤维化的演变过程中扮演着重要的角色[24,25]。本研究揭示HES5是肾细胞调控凋亡的重要分子，并且敲低HES5有可能通过减少细胞凋亡来参与阻止肾纤维化的进展。

肾小管上皮细胞被认为是EMT的参与者，也是受害者，其失去自身的细胞特性而获得肌成纤维细胞特性的过程在各类CKD发生肾纤维化中起重要作用[12,26]。既往研究证实，PI3K的激活触发其下游的关键激酶AKT的活化，从而促进肾小管上皮细胞发生EMT[14,15,16]。PI3K/AKT信号通路的激活可以对肾组织产生不同的生物学效应，包括细胞凋亡、脂质代谢和EMT等。有研究发现，抑制Notch途经可以通过下调PI3K/AKT途径来减轻高糖诱导的足细胞凋亡，从而对糖尿病肾病起保护作用[27];槲皮素通过靶向抑制PI3K/AKT途径可能最大限度地减轻大鼠的肾纤维化和细胞凋亡[28]。本研究结果显示TGF-β1 会诱导HK-2细胞中 PI3K/AKT 通路表达上调，而敲低HES5可抑制TGF-β1 诱导的 PI3K/AKT通路的激活。通过使用PI3K抑制剂处理过表达HES5组后，Vimentin表达的促进作用被减弱。以上研究结果表明，敲低HES5有可能通过降低PI3K/AKT的活化程度发挥其抗纤维化的作用。

综上所述，本研究发现HES5可能在肾小管上皮细胞的EMT进程中扮演关键的角色。敲低HES5的表达可抑制肾小管上皮细胞转分化和凋亡，这可能与PI3K/AKT信号通路活性降低有关。在一定程度上，有望为慢性肾脏病患者抗纤维化治疗提供新思路和有效靶点，但具体机制还有待进一步探讨。

基金资助:国家自然科学基金面上项目(81873606); 重庆市自然科学基金面上项目(CSTB2023NSCQ-MSX0570)Supported by the General Program of National Natural Science Foundation of China(81873606)and the General Project of Natural Science Foundation of Chongqing(CSTB2023NSCQ-MSX0570);

文章来源:张羽寒,衡雪,朱琳,等.HES5对肾小管上皮细胞转分化和凋亡的影响及其机制研究[J].陆军军医大学学报,2024,46(11):1214-1225.