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与MELAS综合征相关的线粒体基因异质性研究进展

2024-07-09 13 上传者：管理员

摘要：MELAS综合征是一种由线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)或核DNA突变引起的遗传性疾病，约80%的病例是由m.3243A>G突变导致线粒体功能障碍而引起的。当细胞中同时存在正常和突变的mtDNA，即为异质性，其与MELAS综合征的严重程度关系复杂。本文将系统阐述与MELAS综合征相关的mtDNA异质性的研究，以期为MELAS综合征的诊疗提供新的思路。

关键词：
ME-LAS
MELAS综合征
基因突变
异质性
线粒体DNA
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MELAS综合征又称为线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作（mitochondrial encephalomyopathy with lactic acidosis and stroke-like episodes,ME-LAS），是一种由线粒体DNA (mitochondrial DNA,mt DNA）或核DNA突变导致的多系统代谢性疾病；MELAS综合征患者发病年龄跨度很大，临床表现复杂多样，以脑组织和骨骼肌受累最为严重，易误诊、病死率高，其中约80%的病例是由m.3243A>G突变导致[1]。

mt DNA是除细胞核染色体以外的基因组，具有自我复制、蛋白质合成等功能[2]。研究[3]表明，当mt DNA突变率超过60%～95%时，致病性mt DNA突变可导致各种临床表现，这一发现对于研究疾病的严重程度及预后提供了依据。目前，MELAS综合征尚且缺乏根治手段，需要多学科的联合管理，以治疗各个系统的损害和预防各种并发症为主。对于携带mt DNA基因突变的妊娠母体，因其含有不同突变负荷的mt DNA在卵子细胞内随机分布，子代的产前诊断仍存在较大困难。本文将对与MELAS综合征相关的mt DNA异质性的研究进行综述，旨在提高MELAS综合征的诊断水平，改善MELAS综合征患者的预后，为MELAS综合征的基因治疗提供新的思路。

1、 mt DNA与MELAS综合征

线粒体是真核细胞的能量代谢中心，通过氧化磷酸化为机体提供ATP，参与合成体内糖类、脂质、蛋白质及多种酶等，同时也参与维持机体的内环境稳定、调控细胞凋亡和提供氧自由基等重要的生命活动[4,5]。人类mt DNA是一个闭合环状基因组，由16 569对碱基对组成，包括1个调控mt DNA复制和转录的非编码D环区，2个r RNA基因、22个t RNA基因和13个参与线粒体氧化磷酸化的复合物亚基基因[6]。

mt DNA缺少有效的突变修复机制，突变率约是核基因的10～20倍，故线粒体疾病由mt DNA突变导致较为常见[7]。研究表明，mtDNA突变导致的线粒体疾病病情较轻、出现较迟，甚至到成年期发病，并且会出现随着年龄增长、病情进行性加重的情况；其临床表现复杂多样，不同基因突变所对应的临床表型不同，甚至同一基因突变亦可导致不同的临床表型，且具有母系遗传、异质性、阈值效应等特点[8,9]。目前已证实突变负荷、阈值效应和有丝分裂分离与线粒体疾病的不同临床表现相关[9]。

线粒体是真核生物进行氧化代谢的部位，是糖类、脂肪和氨基酸最终氧化释放能量的场所。人体中脑和骨骼肌能量代谢最为活跃，因此线粒体功能障碍最易导致脑或骨骼肌受累，从而引起线粒体脑肌病[10]。MELAS综合征是一种最常见的累及中枢神经系统的遗传性线粒体疾病，可起病于任何年龄阶段，发病高峰在10～30岁；其临床表现不一，包括卒中样发作、癫痫、认知与精神障碍、高乳酸血症、运动不耐受和（或）肌无力、头痛、感音神经性耳聋、周围神经病、胃肠功能障碍、身材矮小/生长发育迟滞和糖尿病，以及内分泌异常等[1,11]。目前已发现与其相关的mt DNA基因突变有40多个，其中80%以上的患者为m.3243A>G突变；该突变位于线粒体编码的t RNA亮氨酸1基因上，从而影响t RNALeu的立体构象，干扰其氨酰化、加工、转录后修饰及蛋白质的合成等，导致线粒体功能障碍诱发MELAS综合征[1,11,12]。随着基因检测技术的普及，还发现了其他基因突变位点，如m.13513G>A、m.3271T>C等，但因其患者人群较少，未见相关系统研究[11,12]。

2、 MELAS综合征患者不同细胞或组织中的mt DNA异质性

人类不同组织中线粒体的数量存在差异，每个细胞中大约有100～1 000个不等的线粒体，每个线粒体内大约有2～10组mt DNA，它们的序列通常是一致的，这称为同质性[13]。当细胞中mt DNA发生突变时，细胞中的野生型mt DNA和突变型mt DNA以某种比例共存，称之为异质性[12]。当突变型mt DNA的比例超过组织特异性的临界阈值水平时，才会引起细胞生化缺陷，从而表现出疾病临床表型[3]。mt DNA异质性水平的差别是导致不同的患者之间以及同一家族不同的个体之间临床表型差异的主要原因之一[13,14]。其中，MELAS综合征患者多为母系遗传，散发患者也不少见；但在母系遗传的同一家系中，不同患者的临床表现可以有显著的异质性，如部分患者的母亲仅表现为糖尿病、感音神经性耳聋或身材矮小[1]。此外，mtDNA异质性可以在时间上发生变化，例如血细胞的mt DNA异质性水平随着年龄的增长而降低，这种变化使得其与疾病的严重程度关系更加复杂[10,12]。

理论上可以在每个组织中评估mt DNA异质性，但存在两个现实问题：样本获取的便利性和样本间异质性水平的差异；因此，检测适当的组织以进行准确的遗传诊断显得尤为重要。不同的组织在出生时可能具有相似的mt DNA异质性水平，但随着年龄的增加。尤其是成年后，有丝分裂后的细胞（如骨骼肌细胞和尿液上皮细胞）往往比有丝分裂期的细胞（如毛囊细胞和颊黏膜细胞）具有更高和更稳定的mt DNA异质性水平[15]。血细胞往往拥有最低的mt DNA异质性水平，且随着年龄的增长而降低[16]；而血浆的mt DNA存在于细胞外囊泡中，但其异质性水平也随着年龄的增长而降低[17]。由于尿液易获得、采集无创、突变率高等特点，被普遍认为可作为MELAS综合征患者及其亲属基因测序的首选标本[14,18,19]。关于尿液的突变率比外周血细胞高的原因，可能由于外周血细胞对能量的需求大、分裂速度较快，会自然选择地淘汰mt DNA突变率高的那一部分[18]；也可能由于部分对细胞伤害较轻的mt DNA突变存在于生命周期较短的细胞中，不会对细胞产生较大的影响，进而允许突变mt DNA的累积等[19]。

组织中含有多种不同类型的细胞，同时细胞组成的差异也取决于性别、年龄和疾病状态等其他因素的影响，如果要进行诊断性检测，则需要研究细胞含量的变异性及其对mt DNA异质性水平的影响。WALKER等[20]通过单细胞ATAC测序技术分析MELAS综合征患者的血液细胞mt DNA异质性水平发现，细胞广泛存在mt DNA异质性，但淋巴细胞的mt DNA异质性水平低于髓系谱的mt DNA异质性水平，而T细胞则始终表现出最低的水平；导致这一现象的原因可能是针对T细胞谱系中致病mt DNA等位基因的纯化选择作用，但对于这种选择是否与免疫或代偿相关尚未可知。

3、 mt DNA异质性在MELAS综合征中的应用

目前已经进入到了精准医学的时代，基因检测是诊断MELAS综合征的金标准，且是一种无创、准确的方法，阳性率可达95%以上[1,21]。mt DNA异质性水平的确定将有助于研究其与临床表现的相关性、基因诊断的敏感性、疾病的预后以及疾病传播的遗传咨询等。

3.1 mt DNA异质性与MELAS综合征的临床表型

mtDNA异质性水平与MELAS综合征的临床表型相关[22]。然而，具有相同水平mt DNA异质性的患者可表现出截然不同的症状，部分高水平mt DNA异质性的患者也可相对无症状；mt DNA拷贝数和核因子等因素可能与这些表型的存在有关[23]。SCHOLLE等[16]在1例不具有MELAS综合征表型患者的中枢神经系统样本中检测出>75%的mt DNA异质性，这表明组织中的高水平mt DNA异质性不一定会导致特定的表型。因此，mt DNA异质性的分析必须彻底，同时也应该根据年龄进行适当的调整，以获得准确的解释。例如，血液的mt DNA异质性长期以来表现出低于其他组织，与疾病严重程度的直接关联弱于尿沉渣，且与年龄相关、随着年龄的增长而降低[14,16,17,18,19]。然而，GRADY等[14]发现尿液的mt DNA异质性与性别相关，女性比男性低约20%，而性别校正后的尿液mt DNA异质性结合年龄校正后的血液mt DNA异质性和骨骼肌mt DNA异质性具有更好的相关性，可见单纯地采取尿液并不是评估mt DNA异质性水平最可靠的办法。通常来说，较高的mt DNA异质性水平被认为与更严重的疾病相关，但取样组织的不同、年龄以及性别等因素增加了mt DNA异质性的不确定性。

3.2 mt DNA异质性与MELAS综合征的基因诊断

对于mt DNA异质性水平检测的方法，经历了从Sanger测序、聚合酶链反应/限制性片段长度多态性分析（PCR/RFLP），到q PCR、d PCR的发展，检测的灵敏度更高。目前，多项研究[24,25]表明Taq Man-MGB q PCR方法能够可靠地定量检测4%的mt DNA异质性，可以快速、准确地筛查出大量m.3243A>G突变的低侵袭性样本，更加准确地诊断m.3243A>G突变的流行情况，并阐明不同组织之间临床表型和致病性线粒体突变相互的关联，同时可以更灵敏地检测m.3243A>G突变频率。此外，SHOOP等[26]基于d PCR技术中的荧光标记探针，根据探针结合的序列中是否存在单个核苷酸变化而表现出不同的强度，以精确地测定mt DNA拷贝数和异质性水平。

3.3 mt DNA异质性与MELAS综合征的预后

MELAS综合征患者可以诱发其他的并发症，且mt DNA异质性水平与疾病的预后息息相关。FAYS-SOI等[27]发现尿液中的突变负荷≥45%、癫痫发作史和左心室肥厚与不良预后明显相关。一项多中心队列回顾性研究[28]指出，年龄校正后的血液mt DNA异质性与感音神经性耳聋和m.3243A>G变异型患者的卒中样发作风险显著相关，提示mt DNA异质性水平不仅可以预测和分层MELAS综合征的未来风险、识别高风险个体，还可以更好地预测疾病的预后。

3.4 mt DNA异质性与基因治疗

根据mt DNA异质性的特点，衍生出一系列可操纵mt DNA异质性程度的方法以更好地应对线粒体疾病。基因编辑技术通过可编程核酸酶靶向地切割断裂线粒体中突变的mt DNA，以降低细胞内mt DNA异质性水平[29,30]。这些工具酶主要包括锌指核酸酶（zinc finger nucleases,ZFNs）和转录激活样效应因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases,TALENs）以及成簇规律间隔短回文重复序列-相关蛋白（clustered regularly interspersed short palindromic repeats-CRISPR associated proteins,CRISPR-Cas)[29,30]。此外，人类诱导性多能干细胞技术的发展为线粒体疾病提供了患者特异性模型[31]，以及mt DNA突变对不同组织线粒体功能的影响及致病机制的研究[32,33]。

4、展望

MELAS综合征是一种累及多系统的线粒体疾病，其临床表现广泛且反复发作，患者初期可仅表现为癫痫、肌病、糖尿病、心肌病、肾脏病、感音神经性耳聋等单一器官受累的症状和体征。目前，现有的mt DNA异质性研究多围绕组织来开展，但关于单细胞的异质性研究相对较少。近期有研究[32]利用体细胞直接重编程技术，构建了MELAS综合征的神经元模型，指出了不同程度mt DNA异质性的MELAS综合征可以诱导神经元中线粒体的功能和形态的异常，这揭示了mt DNA异质性对MELAS综合征神经元表型的影响。

由此可见，mt DNA异质性水平与MELAS综合征的各个方面密切相关。同时，mt DNA拷贝数、核遗传修饰因子等遗传因素也是影响线粒体疾病临床表型的重要因素。因此，借助基因检测等技术尽早地确诊对于MELAS综合征等线粒体疾病而言显得尤为重要。

参考文献:

[1]北京医学会罕见病分会,北京医学会神经内科分会神经肌肉病学组,中国线粒体病协作组.中国线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作的诊治专家共识[J].中华神经科杂志,2020,53(3):171-178.

[2]王凯莉,陈卫刚,丁新,等.线粒体转录因子A在食管鳞癌中的表达及其机制[J].实用医学杂志,2020,36(9):1164-1171.

[5]金晶,刘雨朦,张栋,等.缺氧条件下CK1δ和PER1可调控BV2细胞的线粒体形态[J].实用医学杂志,2021,37(9):1111-1116.

基金资助:国家自然科学基金资助项目(编号:81771360); 山东省自然科学基金资助项目(编号:ZR 2019MH060); 济宁市重点研发项目(编号:2022YXNS028); 2019年贺林院士新医学临床转化工作站科研基金项目(编号:JYHL2019FMS25);

文章来源:温丽民,李冉,郝延磊,等.与MELAS综合征相关的线粒体基因异质性研究进展[J].实用医学杂志,2024,40(13):1885-1888.