脓毒症(Sepsis)是由感染引起的可导致多器官损伤的全身炎症反应性综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)[1]。肝脏在调节代谢、维持内环境稳定等方面起着关键作用[3]。研究表明，脓毒症早期即可诱发肝损伤，由脓毒症引起的急性肝损伤造成的死亡率高达38.2%～68.0%[4]。因此，早期控制急性肝损伤也是降低脓毒症死亡率的重要方面。

肝脏中存在着多种具有高度异质性的巨噬细胞亚群，根据起源可分为常驻型肝脏巨噬细胞即库普弗细胞(kuffer cells, KCs)和单核细胞衍生的巨噬细胞(monocyte-derived macrophages, MoMφs)[5]。MoMφs在肝脏炎症和纤维化中具有双重调控作用，可根据表型和功能分为促炎的Ly-6Chi和促修复的Ly-6Clo两个亚群[6]。本课题组前期在CCL4诱导小鼠肝纤维化模型上研究发现，吡喹酮(praziquantel, PZQ)具有促进Ly-6Chi亚群巨噬细胞向Ly-6Clo亚群巨噬细胞转化并缓解肝损伤的作用，但对于Ly-6Clo亚群巨噬细胞在PZQ治疗脓毒症所致急性肝损伤中是否具有保护作用鲜有研究。

PZQ是一种高效，低毒，价廉的抗血吸虫经典药物[7]。近来研究显示，PZQ在治疗寄生虫感染以及在一些化合物诱导的炎症中不仅具有抗肝纤维化的作用，也同时具有抗炎作用[8]。本课题组前期研究发现，PZQ在体内可以抑制血吸虫感染小鼠的肝脏炎性因子表达，在体外也可抑制巨噬细胞炎性因子表达[9]。Pinlaor等[10]在华支睾吸虫感染小鼠模型中发现，PZQ能显著减少胆管周围炎症细胞的浸润等组织病理学改变，降低DNA的硝化和氧化损伤及iNOS的表达，提示PZQ具有潜在抗炎作用。然而，PZQ对于脓毒症造成的肝脏损伤是否同样具有抗炎作用鲜有报道。本研究通过检测脓毒症小鼠生存状况、肝功能和肝脏炎症因子水平以明确脓毒症小鼠急性肝损伤程度，并进一步试验研究PZQ对脓毒症小鼠肝脏损伤的保护作用，以及PZQ处理对巨噬细胞亚群的影响，将有助于深入认识巨噬细胞的高度异质性及其在肝脏炎症发生发展过程中的作用。

一、材料与方法

1 材料与仪器

1.1 实验动物与细胞实验

动物C57BL/6雄性小鼠(6～8周龄，平均体重20～25 g),购自南京医科大学医药实验动物中心(动物生产许可证号：SCXK(苏)2016-0002)。RAW264.7巨噬细胞购自海星生物科技有限公司。

1.2 主要仪器与试剂

PZQ、LPS购自美国Sigma公司；DMEM、胎牛血清购自美国Gibco公司，青霉素、链霉素双抗购自江苏凯基生物技术股份有限公司；Trizol、反转录试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技有限公司；PE/CY7 anti-mouse Ly-6C购自美国BioLegend公司。CO2细胞培养箱购自美国Thermo公司；qRT-PCR仪(Light Cycler96)购自美国Roche公司；分析型流式细胞仪(BD FACSVerse)购自美国BD公司。

2 方法

2.1 动物分组与脓毒症小鼠模型建立

将56只C57BL/6雄性小鼠分为4组(每组14只),即正常对照组、正常PZQ对照组、LPS模型组和PZQ治疗组。脓毒症小鼠模型建立[11]:单次腹腔注射10 mg/kg LPS建立脓毒症小鼠模型。腹腔注射LPS数小时后，感染组小鼠逐渐出现活动减少、竖毛等不适情况，12～24 h后出现小鼠死亡表示小鼠脓毒症模型造模成功。

2.2 PZQ混悬液配制及脓毒症小鼠PZQ治疗

按常规配制吡喹酮混悬液[8],4 ℃保存。10 mg/kg LPS造模后1 h, 正常PZQ对照组和PZQ治疗组小鼠给予300 mg/kg PZQ混悬液灌胃，每12 h一次，共2次；正常对照组和LPS模型组小鼠给予同量生理盐水灌胃。

2.3 小鼠血清AST、ALT检测

小鼠麻醉后取眼球血，分离血清后用Olympus AU5400全自动生化分析仪检测血清AST、ALT水平。

2.4 RAW264.7巨噬细胞培养、分组及处理

RAW264.7巨噬细胞于5% CO2的37 ℃恒温培养箱中，采用DMEM完全培养基(89%高糖DMEM+10%胎牛血清+1%双抗)培养。

将RAW264.7巨噬细胞分为4组，即正常对照组、PZQ对照组(30 μg/ml PZQ处理)、LPS刺激组(1 μg/ml的LPS刺激)和PZQ处理组(1 μg/ml的LPS刺激+30 μg/ml PZQ处理)。将1×105/孔的RAW264.7巨噬细胞接种于12孔板并贴壁过夜，用无血清培养基饥饿6 h后用终浓度1 μg/ml的LPS刺激4 h, 再加入终浓度30 μg/ml PZQ处理24 h后收集细胞进行后续检测。

2.5 qRT-PCR检测

用Trizol法提取各组小鼠部分肝组织及各组RAW264.7巨噬细胞总RNA,按照逆转录试剂盒说明书将总RNA逆转录成cDNA后，使用SYBR Green PCR预混液对cDNA进行qRT-PCR实验，以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法分析数据，所需引物由北京擎科生物技术有限公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

2.6 流式细胞术检测

收集培养的RAW264.7巨噬细胞后，弃上清，用预冷的PBS清洗2次，每孔加入适量胰酶消化1 min, 加入完全培养基终止消化，将细胞吹落后收集到离心管中，4 ℃1500 r/min(离心半径8.67 cm)离心5 min, 弃上清；加适量Staining buffer(2% FBS+98% PBS)将细胞悬液密度调整为107个细胞/ml; 每管吸取100 μL细胞悬液至离心管中，并加入Fc受体阻断剂，4 ℃孵育15 min; 各管加入0.3 μl PE/CY7 anti-mouse Ly-6C,4 ℃避光孵育30 min; 孵育结束后，各管加1 mL Staining buffer涡旋混匀，4 ℃1500 r/min离心5 min, 弃上清，各管加入200 μL Staining buffer, 过滤膜，在BD Verse流式仪器上检测Ly-6Chi和Ly-6Clo两群巨噬细胞比例，用Flowjo软件分析数据。

3 统计分析

实验数据均以均数±标准差

表示，采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析，两组之间的比较采用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA Tukey)检验，P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1 吡喹酮治疗对脓毒症小鼠生存率的影响

各组生存率结果显示：PZQ灌胃治疗24 h后的第24、48、60、72和96 h, LPS模型组生存率分别为87.50%、25.00%、0.00%、0.00%和0.00%;PZQ灌胃治疗组生存率分别为100.00%、62.50%、37.50%、25.00%和0.00%,正常对照组与正常PZQ对照组24～96 h小鼠生存率均为100.00%(图1)。

图1 不同处理组中小鼠生存率比较

2 吡喹酮治疗对脓毒症小鼠肝脏功能的影响

检测各组小鼠血清检测肝损伤指标AST、ALT水平结果显示，正常对照组、正常PZQ对照组、LPS模型组和PZQ灌胃治疗组血清中ALT含量分别为(33.33±6.11)、(41.33±2.31)、(145.33±26.63)和(76.00±4.00)U/L,LPS模型组高于正常对照组(t=7.10,P<0.05),PZQ灌胃治疗组低于LPS模型组(t=4.46,P<0.05)(图2A);对应各组血清AST含量分别为(137.33±2.31)、(154.67±12.22)、(272.00±10.58)和(144.00±27.71)U/L,LPS模型组高于正常对照组(t=21.53,P<0.05),PZQ灌胃治疗组低于LPS模型组(t=7.47,P<0.05)(图2B)。

3 吡喹酮治疗对脓毒症小鼠肝脏炎症因子表达的影响

qRT-PCR检测结果显示，正常对照组、正常PZQ对照组、LPS模型组和PZQ灌胃治疗组TNF-α mRNA相对表达水平分别为1.11±0.06、1.08±0.05、14.70±2.61和3.73±0.88,LPS模型组高于正常对照组(t=8.72,P<0.05),PZQ灌胃治疗组低于LPS模型组(t=8.90,P<0.05)(图3A);IL-6 mRNA相对表达水平分别为1.04±0.30、1.01±0.23、2.16±0.26和1.25±0.20,LPS模型组高于正常对照组(t=5.19,P<0.05),PZQ灌胃治疗组低于LPS模型组(t=5.29,P<0.05)(图3B);IL-1β mRNA相对表达水平分别为1.01±0.51、1.08±0.56、6.52±0.67和2.27±1.37,LPS模型组高于正常对照组(t=11.21,P<0.05),PZQ灌胃治疗组低于LPS模型组(t=4.85,P<0.05)(图3C);NLRP3 mRNA相对表达水平分别为1.14±0.38、1.20±0.15、5.94±0.58和1.92±0.35,LPS模型组高于正常对照组(t=15.53,P<0.05),PZQ灌胃治疗组低于LPS模型组(t=12.13,P<0.05)(图3D)。

图2 吡喹酮治疗对脓毒症小鼠血清中ALT、AST水平影响

图3 吡喹酮治疗对脓毒症小鼠肝脏促炎因子TNF-α(A)、IL-6(B)、IL-1β(C)和NLRP3(D)水平的影响

(A),IL-6(B),IL-1β(C)and NLRP3(D)in sepsis mice

4 吡喹酮处理对LPS刺激RAW264.7巨噬细胞炎症因子表达的影响

在体外RAW264.7巨噬细胞系中，正常对照组、PZQ对照组、LPS刺激组和PZQ处理组TNF-α mRNA相对表达水平分别为1.00±0.10、0.86±0.03、16.42±1.58和11.45±2.30,LPS刺激组高于正常对照组(t=16.86,P<0.05),PZQ处理组低于LPS刺激组(t=3.09,P<0.05)(图4A);IL-6 mRNA相对表达水平分别为1.03±0.29、0.79±0.34、578.89±86.54和341.58±73.40,LPS刺激组高于正常对照组(t=11.56,P<0.05),PZQ处理组低于LPS刺激组(t=3.62,P<0.05)(图4B);IL-1β mRNA相对表达水平分别为1.04±0.38、1.24±0.41、319.41±76.61和219.71±16.97,LPS刺激组高于正常对照组(t=7.20,P<0.05),PZQ处理组低于LPS刺激组，但差异无统计学意义(t=2.20,P>0.05)(图4C);NLRP3 mRNA相对表达水平分别为1.02±0.23、0.75±0.18、2.66±0.43和1.09±0.37,LPS刺激组高于正常对照组(t=5.84,P<0.05),PZQ处理组低于LPS刺激组(t=4.75,P<0.05)(图4D)。

图4 吡喹酮处理对LPS刺激RAW264.7巨噬细胞促炎因子TNF-α(A)、IL-6(B)、IL-1β(C)和NLRP3(D)水平的影响

5 吡喹酮处理对LPS刺激RAW264.7巨噬细胞Ly-6Chi亚群巨噬细胞向Ly-6Clo亚群巨噬细胞转化的影响

流式细胞术检测结果显示，正常对照组、PZQ对照组、LPS刺激组和PZQ处理组中RAW264.7巨噬细胞中Ly-6Chi亚群巨噬细胞的百分率分别为(4.93±0.85)%、(3.19±0.35)%、(83.47±1.15)%、(28.07±2.11)%,LPS刺激组Ly-6Chi亚群巨噬细胞的百分率高于正常对照组(t=95.04,P<0.05),PZQ处理组Ly-6Chi亚群巨噬细胞的百分率低于LPS刺激组(t=39.85,P<0.051);Ly-6Clo亚群巨噬细胞的百分率分别为(77.67±2.22)%、(83.43±1.46)%、(5.39±1.18)%和(26.50±2.77)%,LPS刺激组Ly-6Clo亚群巨噬细胞的百分率低于正常对照组(t=49.79,P<0.05),PZQ处理组Ly-6Clo亚群巨噬细胞的百分率高于LPS刺激组(t=12.13,P<0.05)(图5)。

图5 吡喹酮处理对LPS刺激RAW264.7巨噬细胞极化的影响

三、讨论

脓毒症是一种以多器官损伤、氧化应激、炎性细胞因子刺激为特征的难治性疾病症候群，早期即可诱发肝损伤[12],其机制与过度炎症反应密切相关[13]。腹腔注射LPS诱导脓毒症模型虽然不能准确地反映人类脓毒症的复杂性，但能引起机体炎症介质释放并较好模拟脓毒症初期的炎症反应状态[14-15]。

为确定PZQ对脓毒症小鼠生存率以及急性肝脏炎症的保护作用，本研究前期经相关预实验后，采用腹腔注射10 mg/kg LPS造模后给与PZQ灌胃治疗24 h观察PZQ对脓毒症小鼠生存率的影响及对急性肝损伤的保护情况，结果显示LPS组小鼠于24 h时出现死亡，于60 h时全部死亡，与研究报道的LPS构建脓毒症小鼠急性炎症模型死亡率相似[11],表明脓毒症小鼠模型造模成功，而PZQ治疗组小鼠则于48 h时出现死亡，96 h时全部死亡，相较于LPS组小鼠的生存周期明显延长。检测小鼠血清中AST、ALT水平及肝脏促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β和NLRP3 mRNA相对表达水平结果显示，相较于正常对照组小鼠，LPS组小鼠血清AST、ALT水平显著增加，肝脏促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β和NLRP3 mRNA相对表达水平也明显升高，提示LPS能诱导小鼠肝脏组织损伤和炎症反应，而PZQ治疗则能明显降低小鼠血清中AST、ALT水平以及肝脏组织中炎症因子mRNA相对表达水平，表明PZQ能有效减轻脓毒症小鼠肝损伤，对肝脏起到明显的保护作用。

巨噬细胞是脓毒症中过度产生细胞因子的主要来源，在脓毒症炎症反应上起着关键作用[16]。因此，抑制脓毒症发生发展中巨噬细胞炎症因子的产生与释放也是治疗中的主要考量。本研究qRT-PCR结果显示，LPS刺激后的RAW264.7巨噬细胞释放促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β和NLRP3 mRNA相对表达水平增加，表明体外巨噬细胞炎症刺激模型构建成功，而PZQ处理能够降低RAW264.7巨噬细胞中促炎因子的表达水平，提示PZQ对促炎状态的RAW264.7巨噬细胞有抗炎作用。巨噬细胞具有高度异质性，在疾病过程的不同阶段呈现不同功能的细胞表型，而继往将巨噬细胞简单分为具有促炎作用的M1型巨噬细胞和具有抗炎作用的M2型巨噬细胞并不能充分反映肝脏中巨噬细胞极化的复杂异质性[17]。近年来诸多研究根据表型和功能特征，将巨噬细胞分为促炎促损伤的Ly-6Chi和促修复的Ly-6Clo两个巨噬细胞亚群，则能更好反映巨噬细胞表型与功能的特征[18]。本研究采用LPS刺激RAW264.7巨噬细胞后通过流式细胞术检测发现，LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞向Ly-6Chi亚群巨噬细胞的极化，在PZQ处理后发生明显改变，能促进RAW264.7巨噬细胞中Ly-6Chi亚群巨噬细胞向Ly-6Clo亚群巨噬细胞转化。提示体内试验中PZQ治疗的抗炎作用，可能与改变了Ly-6Chi亚群和Ly-6Clo亚群巨噬细胞的组成和功能有关。

已知PZQ是经典的抗蠕虫药物[19]。本课题组前期研究发现，PZQ可以减少血吸虫感染小鼠脾组织炎症因子的表达，发挥抗炎作用[20],也可明显改善急性血吸虫感染小鼠的肾脏炎症和肾功能[21]。有研究表明，PZQ是5-羟色胺2B受体(5-HT2Breceptor)的配体[22-23],且PZQ能抑制NF-κB的活化[10],而脓毒症导致急性肝损伤的机制与细菌产物激活TLR-4 /MyD88/ NF-κB信号通路产生大量炎症因子密切相关[24-26]。但对于PZQ抗炎及缓解脓毒症小鼠急性肝损伤是否是通过5-HT2B受体发挥作用还有待深入研究明确。

综上，本研究揭示PZQ通过促进Ly-6Chi亚群巨噬细胞向Ly-6Clo亚群巨噬细胞转化，减少促炎因子的表达，从而缓解脓毒症小鼠急性肝脏炎症反应并提高小鼠生存率作用，对PZQ临床研究和脓毒症的抗炎治疗提供了试验依据。

参考文献:

[20]王伟,赵成思,缪婷婷,等.吡喹酮治疗对日本血吸虫感染小鼠脾巨噬细胞增殖和炎症反应的抑制作用[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2020,38(3):263-270.

[21]赵成思,秦敏,谭明娟,等.吡喹酮对日本血吸虫急性感染小鼠肾脏功能损伤的影响[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2021,39(2):200-209.

基金资助:国家自然科学基金项目(No.82072301);

文章来源:戴昱婕,胡婷婷,孙捷睿,等.吡喹酮对脂多糖诱导脓毒症小鼠急性肝损伤的保护作用[J].中国病原生物学杂志,2024,19(10):1123-1128.