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甲基莲心碱通过调控NF-κB信号通路减轻脓毒症大鼠急性肺损伤

2024-07-26 8 上传者：管理员

摘要：【目的】探讨甲基莲心碱对脓毒症大鼠急性肺损伤的治疗作用及机制。【方法】采用盲肠结扎穿刺（GLP）法制备脓毒症大鼠模型，造模成功后，将大鼠分为模型组，甲基莲心碱低、高剂量组和甲基莲心碱高剂量+PMA[核转录因子κB（NF-κB）激活剂佛波酯]组，同时设置假手术组，每组15只。术后6 h，给予相应干预，连续2 d。采用苏木素-伊红（HE）染色观察肺组织形态学改变，并进行损伤病理评分；检测肺组织湿干质量比；血气分析仪检测动脉血氧分压（PaO2）和动脉血二氧化碳分压（PaCO2）水平；酶联免疫吸附法（ELISA）测定支气管肺泡灌洗液（BALF）中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）水平；Western Blot法检测肺组织中NF-κB p65、磷酸化NF-κB（p-NF-κB）p65（Ser536）、环氧合酶2（COX-2）蛋白表达水平。【结果】与假手术组比较，模型组大鼠肺组织损伤严重，肺组织损伤病理评分、湿干质量比及PaCO2水平显著升高（P<0.01）,PaO2水平显著降低（P<0.01）,BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6水平以及肺组织中p-NF-κB p65/NF-κB p65比值、COX-2蛋白表达水平显著升高（P<0.01）；与模型组比较，甲基莲心碱低、高剂量组大鼠肺组织损伤明显改善，肺组织损伤病理评分、湿干质量比及PaCO2水平显著降低（P<0.05或P<0.01）,PaO2水平显著升高（P<0.05或P<0.01）,BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6水平以及肺组织中p-NF-κB p65/NF-κB p65比值、COX-2蛋白表达水平显著降低（P<0.05或P<0.01）。然而，PMA干预后，甲基莲心碱对脓毒症大鼠肺组织损伤的改善作用被明显逆转（P<0.01）。【结论】甲基莲心碱可改善大鼠脓毒症急性肺损伤及肺功能，其作用可能与抑制NF-κB信号通路激活，进而减少体内炎症因子释放有关。

关键词：
NF-κB信号通路
急性肺损伤
炎症
甲基莲心碱
脓毒症
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脓毒症（sepsis）常发生于患有严重烧伤、多发伤、外科手术后等严重疾病的患者中，重症患者常因脏器灌注不足导致休克。目前，全球每年脓毒症患者约5 000万，病死率接近20%[1]。炎症失衡是脓毒症的发病基础，而肺部是最容易遭受炎症损伤的器官，为避免临床滥用抗菌药物，减少耐药菌株的产生，安全有效的中药及单体为脓毒症的临床治疗提供了新的选择。甲基莲心碱（neferine）是从中药莲子心（睡莲科植物莲Nelumbo nucifera Gaertn.的成熟种子中的干燥幼叶及胚根）中分离得到的一种具有双苄基异喹啉特殊结构的生物碱，具有抗炎、抗氧化作用[2]。既往研究[3-4]表明，甲基莲心碱在治疗急性肺损伤方面有一定疗效；但对脓毒症急性肺损伤的治疗作用及机制尚不清楚。核转录因子κB(NF-κB）几乎存在于所有细胞中，活化后介导肺部炎症反应的发生[5]。相关研究[6-7]发现，NF-κB信号通路相关蛋白在脓毒症急性肺损伤患者血清中高表达，抑制NF-κB信号通路激活可改善脓毒症急性肺损伤。因此，本研究拟建立脓毒症大鼠模型，探讨甲基莲心碱基于NF-κB信号通路对脓毒症大鼠急性肺损伤的保护作用，以期为甲基莲心碱治疗脓毒症急性肺损伤的临床应用提供依据，现将研究结果报道如下。

1、材料与方法

1.1 实验动物

75只SPF级雄性SD大鼠，6周龄，体质量180～220 g，购自北京维通利华动物实验技术有限公司[生产许可证号：SCXK（京）2021-0006]。动物饲养于南昌大学实验动物科学中心[使用许可证号：SYXK（赣）2021-0004]，于屏障环境中，自由进食饮水，适应性饲养7 d。本研究动物实验方案已获得南昌大学动物科学中心伦理委员会批准（审批号：20220081），并按照《实验动物管理条例》规定进行实验。

1.2 药物

甲基莲心碱（分子式：C38H44N2O6；分子量：624.77；上海源叶生物科技有限公司生产，批号：B20598;HPLC≥98%）。佛波酯（phorbol ester,PMA）（美国MedChemExpress公司，批号：HY-18739）。

1.3 主要试剂与仪器

NF-κB p65、磷酸化NF-κB(p-NF-κB)p65(Ser536）、环氧合酶（COX-2）、GAPDH等抗体（美国CST公司）；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；肿瘤坏死因子α(TNF-α）、白细胞介素1β(IL-1β）、白细胞介素6(IL-6）酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）。GEM Premier3500血气分析仪（上海玉研科学仪器有限公司）；37XC-2倒置生物显微镜（上海光学仪器五厂有限公司）；DNM-9606酶标仪（北京普朗新技术有限公司）；Gel Doc XR凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）。

1.4 造模、分组与给药

参考文献研究[8]方法，采用盲肠结扎穿刺（cecal ligation puncture,CLP）法制备脓毒症大鼠模型，造模方法如下：呼吸麻醉大鼠，腹部剃毛备皮，沿腹中线作2 cm切口，暴露盲肠，于盲肠1/3处用丝线结扎，用针头对穿盲肠末端处，并挤出少许粪便，还纳盲肠后逐层缝合并进行消毒处理。术后6 h以内，大鼠出现寒战、高温（肛温≥40℃）、尿少、呼吸急促、萎靡不振等现象即示造模成功。未造模成功或造模过程中动物死亡，已及时使用备用大鼠补充。将造模成功的大鼠分为模型组，甲基莲心碱低、高剂量组和甲基莲心碱高剂量+PMA(NF-κB激活剂）组，另设置假手术组，每组15只。假手术组大鼠仅暴露盲肠后直接还纳至腹部关闭腹腔，不做结扎穿刺处理。依据本研究前期实验确定的甲基莲心碱有效剂量设置干预浓度梯度。术后6 h，甲基莲心碱低、高剂量组分别给予甲基莲心碱7.5、30 mg/kg腹腔注射，甲基莲心碱高剂量+PMA组大鼠给予腹腔注射甲基莲心碱30 mg/kg、PMA 5 mg/kg[9]（甲基莲心碱及PMA均溶于PBS配制的浓度为1%的DMSO中），假手术组和模型组大鼠腹腔注射给予等体积1%DMSO溶剂。每日1次，连续2 d。

1.5 观察指标与检测方法

1.5.1 肺组织病理学观察及病理损伤评分

取各组大鼠右肺叶，置于4%多聚甲醛中固定24 h，经无水乙醇梯度脱水、石蜡包埋后，于切片机上制作4µm厚切片，将组织切片行HE染色，再经乙醇脱水、二甲苯透明后中性树胶封片，于显微镜下观察各组肺组织形态学改变，并按照文献研究[10]方法进行肺组织损伤病理评分。

1.5.2 肺组织湿干质量比检测

取各组大鼠肺组织，剪去多余结缔组织，PBS冲洗净残留血液，滤纸吸干，于分析天平上称取湿质量（g），再将肺组织置于65℃烘箱中烘干至质量不再变化，于分析天平上称取干质量（g）计算湿干质量比，湿干质量比（%）=湿质量（g）/干质量（g）×100%。

1.5.3 血气分析

采用心脏采血法抽取各组大鼠动脉血，于血气分析仪上检测动脉血氧分压（PaO2）和动脉血二氧化碳分压（PaCO2）值。

1.5.4 ELISA法测定支气管肺泡灌洗液（BALF）中TNF-α、IL-1β、IL-6水平

使用PBS对大鼠进行双肺灌洗得到BALF，以4 000 r/min（离心半径10 cm）离心10 min，弃沉淀取上清，按照ELISA试剂盒说明书操作，设置标准孔。于酶标仪450 nm波长处读取各孔吸光度（OD）值，根据标准曲线计算BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.5.5 Western Blot法检测肺组织中NF-κB p65、p-NF-κB p65、COX-2蛋白表达水平

取各组大鼠肺组织，PBS冲洗净残留血液。称取50 mg右肺叶置于EP管中剪碎，加入放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液匀浆。将匀浆液置于冰上充分裂解1 h，以4 000 r/min离心10 min，离心半径为10 cm，取上清进行蛋白定量。将蛋白定量后的样本以30µg每孔上样于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶，100 V、100 min电泳后进行转膜（PVDF膜，20 V、10 min）。5%脱脂牛奶室温封闭1 h，分别加入一抗[NF-κB p65、p-NF-κB p65(Ser536）、COX-2、GAPDH,1∶1 000稀释]4℃孵育过夜。TBST缓冲液冲洗3次后加入二抗（1∶10 000稀释）室温孵育1 h。洗膜后，加ECL化学发光液显影，凝胶成像仪上分析获取条带。以ImageJ软件进行灰度扫描，计算条带灰度值。目的蛋白表达水平以目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值的比值表示。

1.6 统计方法

采用SPSS 26.0软件分析数据，以Graphpad Prism 8.0软件绘制统计图，计量数据以均数±标准差（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，两组比较采用LSD-t法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 甲基莲心碱对脓毒症大鼠肺组织病理学及湿干质量比的影响

图1结果显示：假手术组大鼠肺组织结构清晰，肺间质未见水肿、出血及炎性细胞浸润；模型组和甲基莲心碱高剂量+PMA组大鼠肺组织结构被破坏，肺间质可见明显增生及炎性细胞浸润；甲基莲心碱低、高剂量组大鼠肺组织损伤较模型组明显减轻，肺组织结构相对完整，少量炎性细胞浸润。

表1结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠肺组织损伤病理评分、湿干质量比显著升高（P<0.01）；与模型组比较，甲基莲心碱低、高剂量组大鼠肺组织损伤病理评分、湿干质量比显著降低（P<0.05或P<0.01）；与甲基莲心碱高剂量组比较，甲基莲心碱高剂量+PMA组大鼠肺组织损伤病理评分、湿干质量比显著升高（P<0.01）。

2.2 甲基莲心碱对脓毒症大鼠PaO2和PaCO2的影响

表2结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠PaO2水平显著降低（P<0.01),PaCO2水平显著升高（P<0.01）；与模型组比较，甲基莲心碱低、高剂量组大鼠PaO2水平显著升高（P<0.05或P<0.01),PaCO2水平显著降低（P<0.05或P<0.01）；与甲基莲心碱高剂量组比较，甲基莲心碱高剂量+PMA组大鼠PaO2水平显著降低（P<0.01),PaCO2水平显著升高（P<0.01）。

图1 各组大鼠肺组织病理学结果（HE染色，×200）

表1 各组大鼠肺组织损伤病理评分及湿干质量比比较

2.3 甲基莲心碱对脓毒症大鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影响

表3结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著升高（P<0.01）；与模型组比较，甲基莲心碱低、高剂量组大鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著降低（P<0.05或P<0.01）；与甲基莲心碱高剂量组比较，甲基莲心碱高剂量+PMA组大鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著升高（P<0.01）。

表2 各组大鼠PaO2和PaCO2水平比较

2.4 甲基莲心碱对脓毒症大鼠肺组织NF-κB信号通路的影响

图2结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠肺组织中p-NF-κBp65/NF-κBp65、COX-2蛋白表达水平显著升高（P<0.01）；与模型组比较，甲基莲心碱低、高剂量组大鼠肺组织中p-NF-κB p65/NF-κB p65、COX-2蛋白表达水平显著降低（P<0.05或P<0.01）；与甲基莲心碱高剂量组比较，甲基莲心碱高剂量+PMA组大鼠肺组织中p-NF-κB p65/NF-κB p65、COX-2蛋白表达水平显著升高（P<0.01）。

表3 各组大鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较

图2 各组大鼠肺组织p-NF-κB p65(Ser536）、NF-κB p65、COX-2蛋白表达比较

3、讨论

急性肺损伤是脓毒症最常见的并发症。脓毒症时，大量促炎因子的产生和组织缺氧破坏了肺上皮屏障，使液体和蛋白质渗漏到肺泡空间中，导致肺部水肿、呼吸功能受损，进一步发生病理性损伤[11]。本研究通过建立脓毒症大鼠模型，采用HE染色、血气分析等检测方法观察甲基莲心碱对脓毒症肺损伤的影响，结果显示，经甲基莲心碱干预后，脓毒症大鼠肺组织病理损伤明显减轻，动脉PaO2水平升高、PaCO2水平降低，表明甲基莲心碱对脓毒症大鼠肺组织具有保护作用，可改善呼吸功能。

NF-κB是一类具有启动基因转录功能的蛋白质，能调控多种炎症和免疫基因的表达，由p50和p65两个亚基构成，其中，p65直接参与转录过程。临床研究[12]表明，脓毒症发生时大量炎性细胞被激活，患者体内TNF-α、IL-1β、IL-6炎症因子水平异常升高。这些炎症因子释放出的炎症介质诱导NF-κB活化，使NF-κB p65被磷酸化进入细胞核促进下游基因表达[13]。COX-2是具有环氧合酶和过氧化物酶功能的双重酶，COX-2基因启动子中含有NF-κB的结合位点，通常在组织损伤、炎症等情况下表达增强，在炎症激活的情况下COX-2和p-NF-κB p65呈正相关[14]。Wang等[15]研究表明，阻断NF-κB/COX-2信号通路，可减轻机体炎症反应和氧化应激水平，从而改善LPS诱导的小鼠急性肺损伤。而本研究旨在探讨调控NF-κB信号通路对脓毒症所致急性肺损伤的作用，结果显示，脓毒症大鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6水平及肺组织中p-NF-κB p65/NF-κB p65、COX-2蛋白表达水平均升高，表明脓毒症NF-κB信号通路被激活，肺部出现严重的炎症损伤。经甲基莲心碱干预后，脓毒症大鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低，肺组织中p-NF-κB p65/NF-κB p65、COX-2蛋白表达水平亦降低，表明甲基莲心碱对脓毒症大鼠急性肺损伤的改善作用可能是通过调控NF-κB信号通路实现的。为了进一步证明这一结果，本研究采用NF-κB激活剂PMA进行干预，结果显示PMA逆转了甲基莲心碱对脓毒症大鼠肺损伤的改善作用，表明甲基莲心碱对脓毒症大鼠肺组织的保护作用是通过调控NF-κB信号通路实现的。

综上所述，甲基莲心碱可改善大鼠脓毒症急性肺损伤及肺功能，其作用机制可能与抑制NF-κB信号通路激活，进而减少体内炎症因子释放有关。亦提示甲基莲心碱可能是脓毒症急性肺损伤的潜在治疗药物，这对开发利用中草药资源有着积极意义，后续还将对其安全性进行进一步探索。

参考文献:

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基金资助:江西省卫生健康委科技计划项目(编号:SKJP220211237);

文章来源:游燕,闫智杰.甲基莲心碱通过调控NF-κB信号通路减轻脓毒症大鼠急性肺损伤[J].广州中医药大学学报,2024,41(08):2122-2127.