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Cx43体外对Mac-1缺失的黑色素瘤体外生长的抑制作用

2025-01-09 26 上传者：管理员

摘要：目的探究缝隙连接蛋白(Cx)43对巨噬细胞分化抗原(Mac)-1缺失黑色素瘤细胞体外生长的抑制作用。方法检测人正常表皮黑色素细胞(B16-F10、M14、A375)、黑色素瘤细胞PIG1Cx43、Mac-1表达量，黑色素瘤细胞B16-F10传代培养后分为Mac-1-NC组、si-Mac-1组、Cx43-NC组、Cx43组、si-Mac-1+Cx43-NC组、si-Mac-1+Cx43组，检测对比各组细胞增殖、凋亡情况。结果与人正常表皮黑色素细胞PIG1相比，黑色素瘤细胞B16-F10、M14、A375中Cx43表达量显著下降，Mac-1表达量显著上升，且B16-F10中Cx43表达量显著最低，Mac-1表达量显著最高(P<0.05),故选择B16-F10细胞进行后续研究。与Mac-1-NC组相比，si-Mac-1组凋亡率、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)相关X蛋白(Bax)表达上升，Mac-1、Bcl-2表达、增殖率下降，差异显著(P<0.05)。与Cx43-NC组相比，Cx43组Cx43、凋亡率、Caspase-3、Bax表达上升，Bcl-2表达、增殖率下降，差异显著(P<0.05)。与Mac-1-NC组相比，Mac-1组WT-Cx43荧光素酶活性显著降低(P<0.05)。与si-Mac-1+Cx43-NC组相比，si-Mac-1+Cx43组Mac-1、Bcl-2表达量、增殖率下降，凋亡率、Caspase-3、Bax表达量上升(P<0.05)。结论 Mac-1缺失可造成黑色素瘤细胞凋亡率上升，增殖率下降，而过表达Cx43可增强Mac-1缺失的造成的黑色素瘤生长受抑，为临床黑色素瘤治疗提供了新方向。

关键词：
免疫反应
巨噬细胞分化抗原-1
恶性肿瘤
缝隙连接蛋白43
黑色素瘤
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近年来，黑色素瘤发病率呈上升趋势，该病发展涉及多个细胞因子异常表达[1],若早期诊断可治愈，但早期并无症状，所以一经发现已经晚期，增加了治疗难度。巨噬细胞分化抗原(Mac)-1可参与机体免疫反应、防御作用，且可对白细胞浸润、迁移等造成影响，而白细胞对肿瘤生长、转移具有促进作用，其表达缺失可造成黑色素瘤细胞生长受到抑制[2]。缝隙连接及通讯在肿瘤的发生发展中具有重要作用[3]。缝隙连接蛋白(Cx)43是在体内广泛表达的跨膜蛋白家族成员，主要参与细胞缝隙连接通讯，多种恶性肿瘤中均存在Cx43表达异常缝隙连接通讯功能消失，包括黑色素瘤，Cx43充当着肿瘤抑制因子[4]。基于此，本文以Mac-1缺失黑色素瘤细胞生长影响为切入点，探究Cx43对Mac-1缺失的黑色素瘤体外生长的抑制作用，以期为对黑色素瘤患者分子靶点治疗提供新方向。

1、材料与方法

1.1材料、主要仪器及试剂

研究细胞：黑色素瘤细胞株B16-F10、M14、A375、人正常表皮黑色素细胞株PIG1来自上海细胞研究所。武汉益普生物科技有限公司的RPMI1640培养基，广州锐博生物公司生产的Cx43模拟物及阴性对照、Mac-1抑制物及阴性对照、双荧光素酶报告载体，天根生化科技(北京)有限公司PCR试剂盒，上海抚生实业有限公司的四唑盐(MTT)试剂盒，荧光显微镜(南京伊若达仪器设备有限公司);Caspase-3、Bax、Bcl-2抗体(SCBT公司)。

1.2细胞选择及培养

实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测人正常表皮黑色素细胞、黑色素瘤细胞Cx43、Mac-1表达量，重复3次。最终选择黑色素瘤B16-F10细胞进行后续实验，将黑色素瘤B16-F10放入RPMI1640培养液中，37℃、5%CO2培养箱中培养，每3 d更换1次培养液，细胞贴壁70%～80%时，去除培养基，传代培养后取3～5代细胞。

1.3体外干预

取对数黑色素瘤细胞接种于6孔板，稀释至1×106个细胞/ml,每孔200μl,待细胞融合度达80%,采用Lipofectamine2000进行转染，转染分组：Mac-1阴性对照、Mac-1抑制物、Cx43阴性对照、Cx43模拟物转染至细胞内，记为Mac-1-NC组、si-Mac-1组、Cx43-NC组、Cx43组，将Mac-1抑制物及Cx43阴性对照、将Mac-1抑制物及Cx43模拟物转染至细胞内，记为si-Mac-1+Cx43-NC组、si-Mac-1+Cx43组，转染48 h后进行后续实验。

1.4细胞增殖率、凋亡率检测

黑色素瘤细胞转染48 h后，MTT法测细胞增殖率，胰酶消化生成单细胞悬液，弃上清液，5 ml磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次。将5μg/ml MTT 20μl加入单细胞悬液中，培养4 h、加入二甲基亚砜(DMSO),OD值采用酶标检测仪检测，计算获取增殖率，细胞增殖率=(检测的细胞组OD值/对照组OD值)×100%。TUNEL法测定细胞凋亡率，二氨基苯基吲哚(DAPI)染色封片后的细胞核分别呈现为蓝色荧光(阴性细胞数)、绿色荧光(阳性细胞数),荧光显微镜观察细胞凋亡情况，细胞凋亡指数=凋亡细胞数/总细胞数×100%。重复3次。

1.5检测增殖、凋亡相关蛋白

Western印迹法检测Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达量，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳于每孔加入80μg蛋白后进行，电泳结束后将蛋白电转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉对PVDF膜进行封闭，Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白一抗(1∶1 000)于摇床上室温孵育，共孵育120 min,完成后采用TBST洗膜3次，5 min/次，后将Caspase-3、Bax、Bcl-2二抗(1∶1 000)于摇床上室温孵育，共孵育60 min,完成后采用TBST洗膜3次，10 min/次，化学发光显影采用电化学发光(ECL),以GAPDH为内参，相对条带灰度光密度值采用ImageJ软件分析。

1.6统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行独立样本t检验、F检验。

2、结果

2.1 Cx43、Mac-1在人正常表皮黑色素细胞、黑色素瘤细胞中表达

如表1所示，与人正常表皮黑色素细胞PIG1相比，黑色素瘤细胞B16-F10、M14、A375中Cx43表达量下降，Mac-1表达量上升，且B16-F10中Cx43表达量最低，Mac-1表达量最高，差异具有统计学意义(P<0.05),故选择B16-F10细胞进行后续研究。

2.2抑制Mac-1对黑色素瘤细胞B16-F10增殖、凋亡的影响

如表2所示，与Mac-1-NC组相比，si-Mac-1组凋亡率、Caspase-3、Bax上升，Mac-1、Bcl-2、增殖率下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1 Cx43、Mac-1在人正常表皮黑色素细胞、黑色素瘤细胞中表达

表2抑制Mac-1对黑色素瘤细胞B16-F10增殖、凋亡的影响

2.3 Cx43过表达对黑色素瘤细胞B16-F10增殖、凋亡的影响

如表3所示，与Cx43-NC组相比，Cx43组Cx43、凋亡率、Caspase-3、Bax表达量上升，Bcl-2表达量、增殖率下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.4 Cx43、Mac-1的靶向关系

如表4所示，双荧光素酶报告试验显示，与Mac-1-NC组相比，Mac-1组WT-Cx43荧光素酶活性显著降低(P<0.05),对MUT-Cx43荧光素酶活性影响无统计学意义(P>0.05)。

表3 Cx43过表达对黑色素瘤细胞B16-F10增殖、凋亡的影响

表4双荧光素酶报告试验

2.5 Cx43过表达对Mac-1缺失黑色素瘤细胞B16-F10增殖、凋亡的影响

如表5所示，与si-Mac-1+Cx43-NC组相比，si-Mac-1+Cx43组Bcl-2表达量、增殖率明显下降，凋亡率、Caspase-3、Bax表达量明显上升(P<0.05)。

表5 Cx43过表达对Mac-1缺失黑色素瘤细胞B16-F10增殖、凋亡的影响

3、讨论

多数情况下，黑色素瘤从痣进展为发育不良性肿瘤，最终进展为浸润性肿瘤是一个线性多阶段过程[5～7]。现阶段癌症治疗因分子生物学的发展由细胞水平进展至分子水平，因此对黑色素瘤分子水平进行分析具有重要意义[8～10]。临床研究表明，白细胞浸润密度越高肿瘤预后越差[11]。Mac-1可对白细胞黏附、迁移造成影响，最终介导了炎性反应，且Mac-1与血管内皮细胞表面细胞间黏附分子(ICAM)-1、ICAM-2亲和力较高，可造成血管内皮细胞上白细胞黏附，随后白细胞血管外渗，浸润肿瘤组织，为肿瘤生长提供了有利条件，Mac-1表达缺失可使肿瘤组织内髓系白细胞数目降低，造成肿瘤血管新生障碍，血供不足，以抑制肿瘤生长[12～14]。故本文构建Mac-1缺失黑色素瘤细胞，结果显示Mac-1表达缺失对黑色素瘤生长具有抑制作用。根据Cx43过表达分析结果显示，Cx43过表达可进一步降低Mac-1缺失黑色素瘤细胞增殖率，提升凋亡率。分析其原因为，肿瘤转移中上皮细胞-间充质转化(EMT)发挥着重要作用，EMT过程中上皮细胞失去细胞间黏附及极性，获得间质细胞表型，迁徙力增强，肿瘤发生进展，Cx43可使第二信使、Ca2+等小分子物质及代谢产物通过相邻细胞，形成细胞间缝隙连接，促使上皮细胞恢复正常表型，肿瘤生长随之受抑。且本文双荧光素酶报告基因测定证实与Mac-1与Cx43有直接相互作用，故推断Cx43过表达可抑制Mac-1缺失黑色素瘤细胞生长[15～17]。

细胞凋亡功能失衡对黑色素瘤的生物学行为影响较大，这期间有多种凋亡相关分子参与，Bcl-2、Bax属于Bcl-2家族中控制肿瘤细胞凋亡的主要基因，促凋亡蛋白Bax可激活线粒体凋亡通路，最终造成肿瘤细胞凋亡，而Bcl-2表达增强则可维持线粒膜完整性，抑制细胞凋亡[18～20]。Caspase家族在细胞增殖、凋亡中发挥着关键作用，Caspase-3为细胞凋亡的执行者，正常情况下，Caspase-3以无活性酶原形式在胞质中存在，而当细胞凋亡程序启动时则可造成Caspase-3活化，使得DNA片段化，细胞凋亡[21～23]。本研究发现，Mac-1缺失及Cx43过表达的黑色素瘤细胞Caspase-3、Bax表达量升高；Bcl-2表达量降低。分析其原因为，Cx43与Mac-1均与肿瘤细胞凋亡存在联系，Cx43可恢复正常细胞间隙连接，对细胞内环境稳定、新陈代谢，细胞凋亡、分化、增殖等生理过程均有调节作用，且可提升促凋亡因子Bax表达及Caspase-3活性，降低抗凋亡因子Bcl-2表达，最终促进肿瘤细胞凋亡，Mac-1同样可通过调控Bax、Bcl-2、Caspase-3等凋亡相关蛋白表达而参与细胞凋亡[24]。

综上所述，Mac-1表达缺失后黑色素瘤细胞增殖受抑，凋亡增加，同时过表达Cx43可增强Mac-1缺失造成的黑色素瘤细胞生长受抑，发挥抑癌作用，说明Cx43、Mac-1为黑色素瘤的潜在分子靶向，可为黑色素瘤临床诊治提供指导。

参考文献:

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