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miR-623在膀胱癌中的表达及靶向抑制迁移和侵袭

2021-03-05 332 上传者：管理员

摘要：目的:探讨miR-623在膀胱癌中的表达及通过靶向Fascin1对膀胱癌细胞迁移和侵袭能力的影响。方法:采用实时荧光定量PCR检测正常膀胱上皮组织、膀胱癌组织、正常永生化膀胱上皮细胞系(SV-HUC-1)和膀胱癌细胞系(T24、UMUC3)中miR-623的表达量;采用脂质体瞬时转染miR-623mimics,划痕实验和Transwell侵袭实验检测miR-623过表达后膀胱癌细胞迁移、侵袭能力的改变;生物信息学预测miR-623的作用靶蛋白。miR-623过表达后Westernblot及双荧光素酶报告基因检测其靶点的表达及结合情况;使用Fascin1特异性siRNA观察膀胱癌细胞迁移和侵袭能力的变化,并同时转染miR-623inhibitor进行恢复实验。结果:miR-623在膀胱癌中的表达水平显著低于在正常膀胱组织中的表达(P<0.05),在膀胱癌细胞系(T24、UMUC3)中的表达水平显著低于正常膀胱细胞系(SV-HUC-1)(P<0.05);miR-623过表达显著抑制T24和UMUC3细胞的迁移和侵袭能力。生物信息学预测Fascin1为miR-623的靶基因,在T24和UMUC3细胞中过表达miR-623,能够显著降低Fascin1的蛋白水平;荧光素酶报告基因分析结果证实miR-623作用于Fascin1的3'-UTR。下调Fascin1表达能够抑制膀胱癌T24和UMUC3细胞的迁移和侵袭能力,同时抑制miR-623的表达能够提高细胞的迁移和侵袭能力。结论:miR-623在膀胱癌中表达水平降低,是一个抑癌因子;并可能通过靶向Fascin1调节膀胱癌的侵袭和转移能力。

关键词：
Fascin1
miR-623
细胞侵袭能力
细胞迁移能力
膀胱癌
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miRNA是近年来发现的一类小分子非编码RNA,不仅在生物体细胞分化、增殖、代谢、器官形成及免疫应答等生命活动中发挥重要作用,而且与肿瘤的发生发展密切相关[1]。miRNA在膀胱癌中的作用已经被广泛研究,无论是从癌组织、血液标本、尿液标本的检测,还是对膀胱癌细胞生物学特性的改变,miRNA均有参与调控膀胱癌的发生、发展过程[2,3,4]。

miR-623是一种新发现的miRNA,最近报道在胃癌、胰腺癌和肺腺癌中发挥抑癌因子作用,能够抑制癌细胞生长和肿瘤进展[5,6,7]。然而miR-623在膀胱癌中的作用尚不清楚。本研究检测miR-623在膀胱癌中的表达,观察miR-623对膀胱癌细胞迁移和侵袭的影响,预测miR-623可能靶向调控Fascin1基因,并使用双荧光素酶报告系统检测miR-623与Fascin1基因的结合位点;在抑制Fascin1表达同时抑制miR-623的表达观察细胞迁移和侵袭能力变化,探讨miR-623在膀胱癌发生、发展中的作用和通过Fascin1对膀胱癌细胞侵袭和迁移能力的影响。

1、材料与方法

1.1临床资料

收集2017年01月至2018年12月朝阳市中心医院膀胱癌手术标本50例,病理证实均为膀胱移行细胞癌,对应癌旁膀胱黏膜组织20例(距肿瘤2cm以上)。手术切除后,标本快速冻存于液氮中,后冻存于-80℃冰箱。其中男42例,女8例。年龄33～63岁,平均年龄(52±3.3)岁。

1.2膀胱细胞系

人膀胱上皮永生化细胞系SV-HUC-1、膀胱癌细胞系T24和UMUC-3购自中国科学院上海细胞库。细胞用含10%胎牛血清(Hyclone)的RPMI-1640培养基(Hyclone)在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。

1.3实验材料

miR-623mimics、miR-623inhibitor及对照物、Fascin1siRNA(5'-UACUGAUUUGGUCAUUUUCUG-3'和5'-GAAAAUGACCAAAUCAGUAUU-3')购自上海吉玛生物科技有限公司;实时定量荧光PCR试剂盒购自日本TAKARA公司;转染试剂Lipofectamine3000购自美国Invitrogen公司;一抗兔抗人β-actin、Fascin1购自美国SantaCruz公司;辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗购自中杉金桥生物公司;Transwell孔板和基质胶均购自美国Corning公司。

1.4细胞转染

在37℃、5%CO2培养箱中使用10%胎牛血清的RPMI-1640培养细胞。转染前12h将对数生长期的细胞接种于6孔板(5×105/mL)中,待细胞融合度达50%～60%进行转染,采用Lipofectamine3000作为转染试剂,按照说明书进行转染。转染12小时观察细胞状态并更换新鲜培养基。

1.5实时定量PCR检测miR-623表达

首先采用TAKARA公司Mir-XTMmiRNAFirst-StrandSynthesisKit进行miRNA逆转录反应,再用Mir-XTMmiRNAqRT-PCRTBGreenTMKit进行PCR反应,结果数据采用2-ΔΔCt方法分析。以U6为内参,比较miR-623相对表达量。

1.6Westernblot

胰酶消化收集各组细胞,用RIPA法裂解细胞提取细胞总蛋白,BCA法测蛋白浓度,SDS-PAGE电泳上样量50μg总蛋白,100V恒压电泳1h。半干转印,200mA恒流转印1.5h,将蛋白转移至PVDF膜上,5%脱脂奶粉室温摇床封闭1h后,一抗(1∶2000)4℃孵育过夜。次日TBST洗3×5min,HRP二抗(1∶5000)室温孵育1h,TBST洗3×5min,ECL显影后使用ImageJ软件以β-actin为内参对照进行条带灰度分析。

1.7划痕愈合实验

将各组细胞接种于6孔板内(1×106/mL),当细胞生长达到单层贴壁生长接近100%融合时,用200μL无菌Tip头在6孔板中央划痕,PBS洗两次,洗净脱落漂浮的细胞,使用无血清培养基继续培养细胞。分别于划痕后0h和24h在倒置相差显微镜下拍照,观察细胞划痕愈合情况,计算划痕愈合率。每组细胞做3个平行孔,实验重复3次。

1.8Tranwell小室侵袭实验

Matrigel用无血清RPMI-1640培养基1∶3稀释,每孔的Transwell上室内加80μL稀释Matrigel胶,37℃放置1h备用。24孔板每孔加入500μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基,放入Transwell上室,每小室内加入200μL无血清培养基细胞悬液(5×104/mL)。培养24h后取出上室,用4%多聚甲醛固定30min,1g/L的结晶紫溶液染色10min,PBS冲洗3×5min,风干后置于显微镜下观察,随机选取6个高倍视野计数细胞数并用ImageJ软件分析。

1.9双荧光素酶报告基因检测miR-623与Fascin1的靶向结合

利用TargetScan生物信息学软件初步预测miR-623与Fascin1mRNA3'-UTR区的靶向结合位点;构建含有Fascin1mRNA的3'-UTR的双荧光素酶报告基因体系和3'-UTR突变体,细胞接种24孔板(1×104个/mL),待细胞达到60%融合后进行转染。转染分为miR-623mimics+空载体组、miR-623mimics+3'-UTR野生型组、miR-623mimics+3'-UTR突变型组,设三个复孔。转染后按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书进行操作。

1.10统计学方法

采用SPSS18.0统计软件进行统计学分析。计量资料采用方差分析和SNK-q检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1miR-623在膀胱癌组织和细胞中的表达

实时定量PCR结果显示:与癌旁膀胱黏膜组织相比,膀胱癌组织中miR-623的表达显著降低(P<0.05),见图1A;与永生化正常膀胱上皮细胞系SV-HUC-1相比,miR-623在膀胱癌细胞系(T24和UMUC-3)中的表达水平显著降低(P<0.05),见图1B。

图1miR-623在膀胱癌组织和细胞中的表达

2.2miR-623抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力

实时定量PCR检测转染miR-623mimics后成功过表达miR-623(图2A)。划痕愈合实验表明T24细胞转染miR-623mimics后划痕愈合能力较miR-NC对照组细胞的划痕愈合能力显著下降(P<0.05),见图2B-2C。该结果提示过表达miR-623能够抑制膀胱癌细胞的迁移能力。

图2过表达miR-623对膀胱癌细胞迁移能力的影响

Transwell小室侵袭实验检测膀胱癌T24细胞株的侵袭能力。结果显示:转染miR-623mimics后穿过基质胶和滤过膜的细胞数明显减少(P<0.05),见图3。说明过表达miR-623能够抑制膀胱癌细胞的侵袭能力。

图3过表达miR-623对膀胱癌细胞侵袭能力的影响

2.3miR-623靶向作用Fascin13'-UTR降低Fascin1的蛋白表达水平

经TargetScan预测软件分析,发现Fascin1mRNA3'-UTR与miR-623存在7个碱基互补区(图4A)。双荧光素酶报告基因检测结果显示,过表达miR-623后,T24细胞中Fascin1的转录活性相应下调(P<0.05),而将Fascin1的3'-UTR突变后,miR-623的抑制作用消失(图4B)。使用miR-623mimics作用膀胱癌T24细胞,Westernblot结果显示Fascin1在miR-623mimics转染组表达显著低于miR-NC组(图4C-4D)。

2.4miR-623通过下调Fascin1来抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力

使用Fascin1的特异性siRNA处理膀胱癌T24细胞,发现膀胱癌细胞的划痕愈合能力和细胞侵袭能力显著降低(P<0.05);而在Fascin1siRNA处理组中再加入miR-623inhibitor后,显著提高T24细胞的划痕愈合能力和细胞侵袭能力(图5)。

图4miR-623靶向作用Fascin13'-UTR降低Fascin1的蛋白表达水平

3、讨论

膀胱肿瘤从起始阶段到终末阶段是一个多步骤、多因素的渐进过程,受到一系列基因的调控,引起众多生物学过程的发生[8,9]。近年来研究表明,miRNA的异常表达与肿瘤的发生、发展和侵袭迁移密切相关,成为近几年的研究热点。最近研究发现miR-623能够抑制胰腺癌细胞迁移和侵袭以及体内的转移过程,能够成为预防胰腺癌转移的新型辅助治疗靶点[5]。miR-623可能在胃癌中起肿瘤抑制剂的作用,对于胃癌患者,特别是那些具有化疗耐药性的患者,可能是一种很有前景的治疗靶点[6]。miR-623在肺腺癌中下调并通过ERK/JNK/MMP-2/9/Ku80x信号通路抑制癌细胞的侵袭和迁移,提示miR-623可以作为肺癌治疗中的重要治疗靶标[7]。

本课题组首次研究了miR-623在膀胱癌组织中的表达和对膀胱癌细胞迁移、侵袭能力的影响。我们发现miR-623无论在膀胱癌组织还是膀胱癌细胞系中的表达水平均显著低于癌旁膀胱黏膜组织和正常膀胱上皮细胞系。提示miR-623可能与膀胱癌的发生密切相关,可能作为膀胱癌的分子标志物以及治疗靶点。肿瘤的发生和发展包含许多生物学功能的改变,其中迁移和侵袭能力是癌症进展和预后极其重要的影响因素之一,关系到肿瘤的远端转移[10,11]。本研究发现miR-623过表达后,能够显著抑制膀胱癌细胞的侵袭和迁移能力。

图5miR-623通过下调Fascin1抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力

为了进一步研究miR-623在膀胱癌细胞侵袭和迁移中作用的分子机制,我们通过生物信息学预测发现Fascin1为miR-623的预测靶基因。Fascin1作为细胞骨架蛋白,在具有突起的细胞结构上表达浓度较高,能够通过影响细胞的变形及对临近正常组织的浸润能力,促进癌细胞的转移或者淋巴结浸润的发生[12]。我们在前期研究中已经发现Fascin1在膀胱癌的侵袭和迁移中发挥重要的作用[13,14],且在肾癌、胃癌、结肠癌和非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤中发挥促癌作用,参与肿瘤的侵袭和迁移[15,16,17,18,19]。本研究进一步通过在膀胱癌细胞中过表达miR-623发现Fascin1蛋白表达水平显著降低,并通过双荧光素酶报告基因检测发现miR-623能够作用Fascin1mRNA的3'-UTR区负性调节Fascin1的转录活性。这些实验结果证实Fascin1是miR-623的靶基因并受其转录调节。通过RNAi的方式下调Fascin1表达后,发现膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力受到抑制。但当我们在对Fascin1敲减的膀胱癌细胞转染miR-623inhibitor后,癌细胞的迁移和侵袭能力得到恢复。说明miR-623是通过调节Fascin1的表达来影响膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力。

综上所述,在膀胱癌组织中miR-623呈低表达水平,在体外细胞中miR-623能够与Fascin1mRNA的3'-UTR区靶结合并抑制Fascin1蛋白表达,进而抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭。提示miR-623可能参与调控膀胱癌的发生、发展进程,可作为膀胱癌诊断、预后判断的分子标志物和研究膀胱癌侵袭迁移的重要靶点;但miR-623在膀胱癌中发挥的作用并非仅限于迁移和侵袭方面,可能在增殖、凋亡、耐药等其它方面也有影响,还有待更多的实验证明。

陈雪磊,刘光华.miR-623在膀胱癌中的表达及靶向Fascin1抑制膀胱癌细胞迁移和侵袭[J].现代肿瘤医学,2021,29(07):1129-1134.