乳腺癌已经成为当今影响人类健康的重要威胁，每年造成了成千上万的人死亡。针对乳腺癌的治疗，由于传统手术肿瘤切除的高创伤和化疗的毒副作用，使其治疗作用往往不尽人意，同时还有复发的风险，给患者带来了身体上和经济上的双重负担[1,2]。放疗作为一种高能量和高穿透能力的治疗手段，近年来已广泛地应用到深部实体肿瘤的治疗中。当含有高能量的射线照射实体瘤时，射线会直接损伤肿瘤细胞DNA,进而导致肿瘤细胞的增殖减少，最终杀灭肿瘤[3,4]。此外，高能射线还能通过作用于肿瘤细胞中的过氧化氢和氧气，产生具有细胞毒性的活性氧，使肿瘤细胞发生氧化应激，进而走向死亡[5,6]。然而，由于肿瘤细胞的缺氧微环境，使肿瘤的放疗效果受限。

近年来，含有高原子序数的金属纳米药物用于肿瘤的放射增敏已被广泛研究[7,8,9,10]。具有电子未占空轨道的金属原子吸收高能射线的辐射能量，再与水和氧气发生电子交换，生成具有细胞毒性的活性氧，例如单线态氧、过氧化氢、羟基自由基、超氧阴离子，氧化损伤肿瘤细胞的DNA、脂质化物和蛋白质，诱导细胞发生凋亡和铁死亡[11]。因此，通过提高氧浓度，改善实体肿瘤的缺氧微环境，同时增强肿瘤细胞对射线的敏感性成为肿瘤放疗的重要策略。MnO2纳米颗粒具有良好的水溶性和低毒性，近年来已广泛地应用于实体肿瘤的放射治疗中[12]。MnO2纳米颗粒能在肿瘤细胞中催化过氧化氢反应生成氧气和细胞毒性的羟基自由基，在改善肿瘤缺氧微环境的同时极大地提高了射线诱导的活性氧生成，产生氧化应激和更强的放疗杀伤效果[13,14]。由于细胞自身存在的保护机制对射线产生辐射抵抗，导致MnO2纳米颗粒的放疗效果不能完全发挥出来。因此，开发兼具氧气生成和抑制辐射抵抗的纳米放疗增敏剂具有显著的迫切性。

QU作为一种纯天然黄酮醇类化合物，具有抗菌、抗过敏和降血脂等生物学活性[15,16]。此外，近年来研究发现QU在癌症治疗中也具有很好的潜力，尤其是可作为放疗增敏剂通过对细胞凋亡的诱导、细胞周期的阻滞及肿瘤乏氧微环境的改善等方式来减轻细胞辐射抵抗从而增强肿瘤的放疗效果[17,18]。但它在实际使用中仍面临许多局限，如水溶性极低、对光敏感，容易降解等。因此，基于MnO2纳米颗粒的优异载药性能和QU的放射增敏作用，本研究采用油酸模板法合成MnO2纳米颗粒，再通过物理吸附法负载QU,增强乳腺癌4T1细胞的放射增敏作用。最后，构建小鼠乳腺癌移植瘤模型评价Mn(QU)联合放疗抑制移植瘤生长的作用。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞及动物

小鼠4T1乳腺癌细胞购买于北纳生物技术有限公司，BALB/C小鼠(SPF级雌性，6～8周龄)购买于陆军军医大学实验动物中心。本研究经陆军军医大学伦理委员会批准，并根据《中国实验动物福利和伦理指南》进行。

1.1.2 主要试剂

DMEM培养基、链霉素/青霉素、胎牛血清 、胰蛋白酶购买于赛默飞世尔生物化学制品有限公司，CCK-8试剂购买于重庆葆光生物技术有限公司，γ-H2AX荧光染色检测试剂盒和活性氧检测试剂盒购买于上海碧云天生物技术有限公司，凋亡试剂盒购买于普诺赛生物科技有限公司，油酸购买于国药集团化学试剂有限公司，高锰酸钾(AR级)购买于国药集团化学试剂有限公司，无水乙醇购买于阿达玛斯试剂有限公司，槲皮素购买于麦克林生化科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 纳米材料制备

将10 mL油酸滴加入500 mL高锰酸钾水溶液(2 g/L)中，室温下剧烈搅拌。反应液在室温下保持12 h搅拌使其反应完全，生成的棕黑色产物用去离子水洗3次去除未反应的高锰酸钾，用乙醇洗5次去除残留的油酸或氧化油酸，离心后在60 ℃下干燥即得MnO2纳米颗粒，于-20 ℃保存备用。称取20 mg MnO2纳米颗粒分散在5 mL乙醇中，然后将5 mL QU乙醇溶液(2 mg/mL)滴加入混合液中。搅拌24 h后，离心用乙醇进行3次洗涤，即得Mn(QU) 纳米材料，于-20 ℃保存。

1.2.2 纳米材料表征和Mn(QU)产氧能力测定

采用扫描电子显微镜(ZEISS)观测MnO2纳米颗粒形貌，即滴加MnO2纳米颗粒在硅片上，经喷金处理，通过扫描电镜(3 kV加速电压)观察形貌结构。采用透射电镜(Hitachi)分析MnO2纳米颗粒微观形貌和粒径大小，即滴加MnO2纳米颗粒在铜网上，通过透射电镜(加速电压100 kV)观察材料形貌以及粒径。采用能量色散X射线光谱仪(EDS)进行MnO2纳米颗粒的元素组成分析。采用傅里叶变换红外光谱仪(Perkin Elmer)测定QU、MnO2、Mn(QU)的红外吸收光谱图。采用紫外分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)对QU、MnO2、Mn(QU)的组分进行紫外吸收光谱表征。将50 μg/mL Mn(QU)分散在脱氧水中，在温和搅拌下与不同浓度过氧化氢溶液混合，每20秒用溶解氧仪实时检测氧气浓度，测定Mn(QU)产氧能力。

1.2.3 细胞培养

将DMEM培养基加入10%胎牛血清和1%链霉素/青霉素用于培养4T1细胞并放置于37 ℃、5% CO2含量的恒温培养箱中孵育。通过显微镜监测细胞的生长状态并选取处于对数生长期的细胞用于后续实验。

1.2.4 CCK-8法测定细胞活性

将4T1细胞用胰酶消化，调整细胞的浓度为5 × 104 个/mL,按100 μL/孔接种于96孔板中，待细胞贴壁后分别依次加入浓度为0、12.5、25、50、75和100 μg/mL的Mn(QU)水溶液，每组6孔，放回细胞培养箱孵育48 h后在每孔加入10 μL CCK-8工作液，继续孵育4 h, 用酶标仪获取吸光度OD值，计算细胞的存活率。

细胞存活率(%)=(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)× 100%。

1.2.5 细胞克隆形成实验

将4T1细胞接种至细胞6孔板，分别用QU(6.7 μg/mL)、MnO2(43.3 μg/mL)、Mn(QU)(50 μg/mL)作用24 h后弃掉原培养基，每孔加入PBS进行清洗，然后再加入2 mL新鲜培养基后分别给予0、2、4和6 Gy的X射线生物辐照仪(Rad source 2000)辐照，放回细胞培养箱继续孵育24 h。将细胞用胰酶消化后调整密度为103个/孔后放回培养箱继续孵育。用4%多聚甲醛固定细胞，结晶紫染色，清洗后晾干，拍照。根据单击多靶模型利用GraphPad Prism 软件进行细胞存活曲线拟合，计算放射增敏比(sensitivity enhancement ratio, SER)。

单击多靶模型公式：Survival fraction (SF)=1-(1-e-kD)n;

式中k为细胞存活曲线的钝化常数，n为外推数，k和n的值可由拟合曲线方程直接给出。

SER=D37(对照组)/D37(实验组);D37=D0+Dq; D0=1/k; Dq=ln n×D0;

式中D37表示细胞存活率为37%时所用的辐射剂量；D0为平均致死剂量；Dq为准阈剂量。

1.2.6 γ-H2AX免疫荧光染色

4T1细胞按5 × 104/孔的密度接种于共聚焦培养皿中，放回细胞培养箱孵育贴壁后按下列分组处理：正常对照组(Control)、6 Gy辐照组(RT)、QU+RT组、MnO2+RT组、Mn(QU)+RT组。4%多聚甲醛固定后用PBS清洗3次，每次5 min。加入免疫染色封闭液进行室温封闭60 min, 封闭后加入按1∶200比例稀释的γ-H2AX抗体，4 ℃孵育过夜后再用PBS清洗3次，每次 5 min。加入按1∶500比例稀释的IgG Fab2AlexaFluor(R)555二抗，在室温下进行避光孵育2 h后，用DAPI染色液在室温条件下对细胞核进行复染。用PBS清洗细胞后放置于共聚焦显微镜(ZEISS 800)下进行检测。

1.2.7 细胞ROS检测

将4T1细胞接种于6孔板，按照Control、RT、QU+RT组、MnO2+RT组、Mn(QU)+RT组分组处理后放回细胞培养箱继续孵育24 h, 用PBS清洗细胞后在每孔中加入 1 mL用无血清培养基按1∶1000比例稀释的DCFH-DA,继续孵育40 min后清洗3次，在荧光显微镜(奥林巴斯)下观察并拍照。

1.2.8 细胞死活荧光染色

将4T1细胞接种至6孔板，分组处理同上。每孔加入500 μL 按1∶1 000稀释的Calcein-AM/PI混合工作液，放回细胞培养箱进行30 min避光孵育后在荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.9 流式细胞术测定细胞凋亡

将4T1 细胞接种于6孔板中。分组处理后收集细胞并用PBS清洗。加入100 μL 按1∶10稀释的AnnexinV Binding Buffer 重悬细胞。之后再加入AnnexinV-APC染色液和DAPI染色液各2.5 μL,避光孵育15 min。加入400 μL AnnexinV Binding Buffer后用流式细胞仪(BD verse)检测细胞凋亡。

1.2.10 移植瘤小鼠体内治疗

于BALB/C小鼠右腿前背部皮下接种1×106个4T1细胞(100 μL/只),构建小鼠皮下移植瘤模型，当肿瘤体积长至大约70 mm3,将荷瘤小鼠随机分为五组：正常对照组(Control)、6 Gy辐照组(RT)、QU+RT组、MnO2+RT组、Mn(QU)+RT组，第1天和第4天分别给予PBS、QU(2 mg/kg)、MnO2(13 mg/kg)和Mn(QU)(15 mg/kg)药物瘤内注射治疗，放疗组药物干预4 h后对肿瘤局部进行6 Gy的X射线照射。游标卡尺2 d测量1次小鼠肿瘤的长径(L)和横径(W),并通过V= L×W2/2公式计算肿瘤体积(V),连续测量12天，记录小鼠肿瘤体积变化曲线并计算各组肿瘤生长抑制率。

1.3 统计学分析

使用GraphPad Prism 8.0.3对定量数据进行柱状图绘制和统计分析，数据用

表示。当数据服从正态分布且方差齐时组间差异用单因素方差分析(ANOVA)进行对比。P<0.05 则认为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 纳米材料的理化性质

通过扫描电镜(SEM,图1A)和透射电镜(TEM,图1B)可观察到合成的MnO2 纳米颗粒的直径约为120 nm, 与文献报道一致[19]。利用能量色散X射线光谱仪(EDX)分析MnO2纳米颗粒元素组成。实验结果显示，所合成的纳米颗粒中的主要元素为Mn和O,其原子百分比约为1∶2,证实了所制备的材料是由二氧化锰组成的MnO2纳米颗粒(图1C)。将QU负载到MnO2 纳米颗粒上，合成负载槲皮素的二氧化锰纳米颗粒[Mn(QU)]。利用傅里叶变换红外光谱证明了QU的存在。从图1D中可以看出，1 592 cm-1处的特征峰属于QU的C=O伸缩振动。紫外光谱实验结果也显示Mn(QU)在410 nm波长处出现了一个尖锐的吸收峰，这种现象可能是由于QU(紫外吸收波长为374 nm)与MnO2结合后的吸收峰发生红移导致(图1E),这也进一步证实QU的成功负载。此外，我们建立了QU的浓度与紫外吸光度标准曲线，根据吸光度结果计算出Mn(QU)载药率高达13.4 wt.%。为测定Mn(QU)与过氧化氢反应的产氧能力，我们通过溶氧仪(雷磁，JPB-607A)研究了Mn(QU)在不同pH、过氧化氢浓度条件下的氧气生成能力。如图1F所示，当过氧化氢的浓度不变时，溶液pH越小Mn(QU)的氧气生成能力越强。当溶液的pH不变时，过氧化氢的浓度越高，Mn(QU)的氧气生成能力越强。鉴于肿瘤微环境呈现出弱酸性和高过氧化氢浓度的特性，Mn(QU)有可能通过提升氧气浓度增强肿瘤对放射的敏感性。

图1 纳米材料的理化性质表征

2.2 细胞活性评价

采用CCK-8法评价了Mn(QU)对4T1细胞的活性影响(图2)。实验结果表明，当药物浓度增加到50 μg/mL时，4T1细胞活性仍保持大于90%。药物浓度继续提高，细胞活性略微降低。当药物浓度分别达到75 μg/mL和100 μg/mL时，细胞活性仍大于80%,表明合成的Mn(QU)具有较好的安全性，在50 μg/mL剂量内无明显的细胞毒性。

图2 不同浓度Mn(QU)对4T1细胞的毒性影响

2.3 Mn(QU)的体外放疗增敏抗肿瘤作用

2.3.1 细胞克隆形成实验结果

通过细胞的克隆形成能力评价Mn(QU)处理后的4T1细胞的放射敏感性的改变情况。如图3A所示，与Control组相比，6 Gy 辐照(RT)处理后的4T1细胞克隆形成数目变化不明显，QU联合6 Gy辐照组细胞克隆数略有减少，未表现出显著的放疗增敏活性，MnO2联合6 Gy辐照组细胞克隆数明显减少，显示出一定的放疗增敏活性，而Mn(QU)联合6 Gy辐照组克隆形成数最少。由此可见，经Mn(QU)处理后可增加 RT的肿瘤活性抑制作用。利用单击多靶模型计算细胞的放射敏感性。图3B结果显示，相比于单纯辐照组。Mn(QU) 在同等放射剂量下显示出最低的SF值，计算所得Mn(QU) 联合放疗组的放射增敏比为1.61,与其他组相比Mn(QU) 表现出最强的放射增敏作用。

2.3.2 γ-H2AX荧光染色结果

γ-H2AX是发生DNA损伤时的重要标志物。辐射造成的DNA双链断裂会诱导H2AX磷酸化形成 γ-H2AX,通过测定细胞中 γ-H2AX含量可用于评判DNA的损伤程度和修复情况。如图4所示，Control组中仅有极少量的 γ-H2AX焦点，证明几乎无DNA损伤情况发生。单纯辐照RT组、QU+RT组和MnO2 + RT组有少量的γ-H2AX 焦点形成，而Mn(QU)+RT组中形成大量的γ-H2AX 焦点，表明Mn(QU)+RT处理组的4T1细胞产生的DNA双链断裂数目增加，导致DNA损伤加剧，为Mn(QU) 用于进一步肿瘤放疗增敏治疗提供可能。

2.3.3 细胞ROS荧光染色结果

活性氧ROS是高能射线照射细胞后产生的具有细胞毒性的活性物质，同时也是诱导细胞产生氧化损伤的关键刺激因素，通过检测辐照后细胞内ROS水平可用来评价药物的放疗活性。利用活性氧指示剂，通过共聚焦显微镜检测ROS水平。如图5所示，与Control组相比，单纯辐照RT组和QU+RT组没有表现出很明显的ROS生成，MnO2+RT组表现出一定的辐射诱导ROS生成。然而，Mn(QU) 在同等辐照剂量下具有最多的ROS生成，进一步表明Mn(QU) 具有优异的放疗增敏抗肿瘤能力。

2.3.4 细胞活/死荧光染色结果

Calcein-AM/PI 荧光染色通过检测细胞内酯酶活性和细胞膜完整性，从而反映细胞活性与细胞毒性。如图6所示，与Control组相比，单纯辐照RT组和QU+RT组没有表现出明显的细胞状态变化，MnO2+RT组细胞的死细胞含量略有增多，Mn(QU)+RT组细胞的死细胞含量明显增多，活细胞数量减少，进一步证实 Mn(QU) 联合放疗对肿瘤细胞活性具有明显的抑制作用。

图3 分组处理后的4T1细胞克隆形成影响及SF值的计算

图4 分组处理后的4T1细胞 γ-H2AX 免疫荧光检测和相对荧光强度统计

与Control组相比，a: P<0.001 A:免疫荧光检测各组细胞核 γ-H2AX 焦点形成情况；B:各组细胞 γ-H2AX 焦点数目统计图(n=3)

图5 分组处理后的4T1细胞ROS荧光检测和荧光强度统计

图6 分组处理后的4T1细胞活/死荧光染色图

图7 分组处理后的4T1细胞凋亡图

2.3.5 流式细胞术检测细胞凋亡结果

为评价Mn(QU)的放疗增敏抗肿瘤活性，通过流式细胞仪检测细胞凋亡。实验结果如图7所示，Control、RT、QU+RT、MnO2+RT和Mn(QU)+RT不同处理后的细胞凋亡率(Q2+Q3)分别为3.64%、7.05%、14.9%、15.87%,32.63%。与对照组相比，单纯RT组的细胞凋亡率仅升高了3.41 %,表明4T1细胞在6 Gy辐照下损伤轻微。QU 联合放疗的细胞凋亡率与对照组相比升高了11.26 %,MnO2 联合放疗组相比对照组的细胞凋亡率增加了12.23 %,表现出一定的放疗增敏活性。而Mn(QU) 联合放疗组的细胞凋亡率增加了28.99%,通过加剧4T1细胞凋亡比例显著增强了放疗增敏抗肿瘤作用，表明Mn(QU) 通过增强放射治疗诱导的细胞凋亡比例实现放射增敏的抗肿瘤效果。

2.4 体内抗肿瘤效应评价

为进一步评价Mn(QU)的体内放疗增敏抗肿瘤活性，利用BALB/C小鼠建立了4T1移植瘤模型来评价Mn(QU)在小鼠体内的抗肿瘤能力。实验结果显示(图8),与Control组相比，不同处理组对小鼠肿瘤体积生长抑制能力Mn(QU)+RT组>MnO2+RT组>QU+RT组，表明Mn(QU) 联合放疗对肿瘤生长抑制效果最明显，进一步确证所制备的Mn(QU)优异的体内放疗增敏抗肿瘤能力。

3、讨论

放疗作为一种具有高能量和高穿透力的治疗方式，通过给予肿瘤部位射线照射产生直接或间接的杀伤作用，在临床上已经成为精准医学治疗实体瘤的重要医学手段。但因为放疗对周围正常组织的破坏以及肿瘤的高效代谢速度和对大量氧气的需要，使得肿瘤微环境保持着缺氧的状态，使得放疗后断裂的DNA周围没有充足的氧气产生稳定的氧化合物，无法有效地抑制DNA受损的自动恢复，因此更加进一步限制了放疗的效果。因此怎样通过改变肿瘤的缺氧微环境使放疗抵抗有所缓解是目前的一项研究热点。放疗增敏剂能够在一定程度上解决这些问题对疗效产生的影响。纳米材料作为一门新兴的医工交叉学科，广泛应用于肿瘤放疗增敏[20,21]。和常规化学药物比较，新型纳米材料可以更有效地靶向递送药物，提高灵敏性。纳米材料的尺寸和造型可以变换，从而进一步提高放疗效果。

图8 分组治疗对小鼠移植瘤的体内生长抑制作用

基于MnO2纳米颗粒其优异的物化和生物学性质，近年来已广泛将其应用于肿瘤的放射增敏领域。同时，MnO2纳米颗粒由于良好的生物相容性、形状多样性用于药物递送。如空心MnO2颗粒包载疏水抗癌药物喜树碱(CPT)以实现药物肿瘤微环境响应性递送、改善肿瘤缺氧微环境从而放化疗结合增强肿瘤抑制效果[22];Lin等用人血清白蛋白(HSA)为模板合成MnO2纳米颗粒并包载自噬抑制剂，逆转异常的肿瘤微环境，抑制自噬激活[23]。然而，由于肿瘤细胞的自我保护机制对射线产生辐射抵抗，导致单纯的MnO2纳米颗粒放疗的效果受到限制，难以发挥出最大疗效。

QU是一种有抗肿瘤活性的天然黄酮醇类化合物，它能通过调控细胞周期起到放疗增敏的抗肿瘤治疗功效[18]。Choi JA等发现QU可诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡和G2/M期阻滞，提高细胞的放射敏感性[24]。基于此，我们通过MnO2纳米颗粒作为递药载体，制备的Mn(QU)在增加QU的生物利用率的同时对乳腺癌4T1细胞和小鼠移植瘤具有良好的放射增敏作用。

通过细胞CCK-8实验表明合成的Mn(QU)具有良好的生物相容性。同时克隆形成实验结果发现，与单纯MnO2纳米颗粒相比，Mn(QU)具有更强放疗增敏能力，其放疗增敏比为1.61。γ-H2AX免疫荧光和ROS荧光染色实验证明Mn(QU)相比于单纯MnO2纳米颗粒能显著增加辐射诱导的DNA双链断裂和刺激更多的细胞毒性ROS生成，从而表现更强的4T1肿瘤细胞生长抑制作用。细胞活/死荧光染色结果也显示Mn(QU)能增强4T1肿瘤细胞在射线作用下死亡比例。同时，细胞流式分析结果表明，Mn(QU)能增强4T1肿瘤细胞在射线作用下发生凋亡的比率，其促凋亡作用显著强于其他对照组，表现出最强的拮抗4T1肿瘤细胞生长作用。小鼠移植瘤模型的抑瘤实验结果也表明Mn(QU)联合放疗组具有最优的实体肿瘤生长抑制作用。综上所述，本研究成功合成了Mn(QU)纳米药物并对其进行表征，在细胞水平上可实现放疗增敏，体内移植瘤抑制也取得了较好的成效。

设计的Mn(QU)的放疗增敏抗肿瘤机制可能是MnO2纳米颗粒响应射线照射后肿瘤微环境的高水平过氧化氢，在产氧的同时释放装载的QU。然后，释放的QU可将肿瘤细胞的有丝分裂阻滞在G2/M期，同时破坏肿瘤细胞内的氧化还原平衡，抑制肿瘤细胞的自我保护机制，降低了肿瘤细胞对射线产生的抵抗，从而使MnO2纳米颗粒最大限度地发挥放疗增敏作用，提高了辐射所引起的肿瘤细胞DNA双链断裂和活性氧生成，促进肿瘤细胞凋亡，充分发挥出优异的体内和体外放疗增敏抗肿瘤效果。希望本文的研究能为设计和开发具有更加优异效果的放疗增敏剂提供了新的见解和思路。

文章来源:罗婧文,冉永红,柳随义,等.二氧化锰纳米颗粒负载槲皮素对乳腺癌细胞的放射增敏作用研究[J].陆军军医大学学报,2024,46(12):1344-1352.