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左旋肉碱在渔用配合饲料中含量测定分析

2020-05-23 799 上传者：管理员

摘要：建立了亲水作用色谱-串联质谱法(HILIC-MS/MS)检测渔用配合饲料中左旋肉碱含量的方法。样品用超纯水超声提取,提取液稀释后经HILIC色谱柱分离,以乙腈和乙酸铵(含0.15%甲酸)溶液为流动相梯度洗脱,三重四级杆串联质谱多反应监测(MRM)方式扫描,外标法定量。结果表明,左旋肉碱在0.2～100ng/mL范围线性良好(r>0.999);检出限0.5μg/kg,定量限1.5μg/kg。在20、50和100mg/kg添加水平下,回收率为75.2%～111%,相对标准偏差RSD为3.4%～9.9%(n=6)。该方法前处理简单、快速,定性定量准确,适合于渔用配合饲料中左旋肉碱的准确定性定量。

关键词：
亲水作用色谱-串联质谱
左旋肉碱
渔用配合饲料
类氨基酸
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左旋肉碱(L-carnitine)是一种促使脂肪转化为能量的类氨基酸,广泛分布于自然界,是生物体的基本成分,其中肉类和乳制品中左旋肉碱的含量最高,而蔬菜和水果类左旋肉碱的含量最低[1,2]。水产动物自身能在肝脏和组织中合成左旋肉碱,但在幼体时期,体内合成的肉碱远远不能满足水产动物快速生长的需要,此时其饲料中必须添加一定量的左旋肉碱[3]。近年来,国内外就左旋肉碱对水产动物生长性能的研究表明:左旋肉碱能明显提高鱼类增长速度,提高饲料蛋白质的效率,降低饲料系数,提高鱼肉品质,提高养殖成活率和繁殖率[3,4,5]。

文献中有关左旋肉碱的检测方法有很多[6],研究样品多数为血浆[7,8]、乳制品[9,10,11]、尿液[12]、食品[1,2,13]、保健品[14,15]、减肥产品[16,17]等,未见到有关饲料中左旋肉碱的检测方法报道。笔者建立了亲水作用色谱-串联质谱法(HILIC-MS/MS)检测渔用配合饲料中左旋肉碱含量的方法,该方法通过液相色谱柱分离,质谱选择离子的方法进行定性和定量,减少了干扰,可快速准确地检测渔用配合饲料中左旋肉碱的含量。

1、实验部分

1.1仪器、试剂与材料

LC-20AD液相色谱(日本岛津);QTRAP4500三重四极杆质谱仪(美国ABSCIEX);十万分之一电子天平(赛多利斯,CPA225D);千分之一电子天平(赛多利斯,CP323S),涡旋振荡器(IKA,MS3-digital);高速离心机(安徽科大创新股份有限公,HC-3518);中草药粉碎机(天津泰斯特FW135)。

左旋肉碱对照品(北京索莱宝科技有限公司,纯度≥98%);实验所用超纯水由Milli-Q超纯水机制备;正己烷(色谱纯,Honeywell)。

一次性针式滤器(Pall,25mm,0.22μm)。

1.2实验条件

1.2.1色谱条件

色谱柱GOLDHILIC(50mm×2.1mm×1.9um,Thermoscientific公司),流动相5mmol/L乙酸铵(含V/V0.15%甲酸)(A)和乙腈(B);梯度洗脱:0～1min98%B;1min～3min98%B～10%B;3min～3.1min10%B～98%B;3.1～6min98%B。流速0.5mL/min;柱温40℃;进样体积2μL。

1.2.2质谱条件

电离模式:ESI+,多反应离子检测(MRM)模式;喷雾电压5500V;气帘气40PSi;碰撞气Medium;离子源温度550℃;雾化气(GS1)55PSi;辅助加热气(GS2)55PSi;去簇电压60V;碰撞池出口电压(CXP)6.0V。左旋肉碱母离子为m/z162.0;定性离子对为m/z162.0>85.0,碰撞能26eV;定量离子对为m/z162.0>103.0,碰撞能22eV。

1.3样品前处理

饲料经粉碎机粉碎后,称取1.000g于50mL离心试管中,加入10mL超纯水,涡旋振荡2min,超声提取20min,4000r/min离心10min,上清液倒入25mL比色管中;再加入10mL超纯水重复提取一次,合并上清液,用超纯水定容至25mL。取3mL上清液于10mL离心试管中,加入3mL正己烷,涡旋30s,10000r/min离心10min,去掉上层正己烷层,取下层清液过0.22μm滤膜后用超纯水稀释200倍,供上机测试。

2、结果与讨论

2.1色谱柱的选择

实验中考察了左旋肉碱在HypersilgoldC18,AccucoreaQ,ZORBAXRX-C8和KinetexF5,HypersilGOLDHILIC色谱柱上的保留和分离能力。结果表明左旋肉碱在HypersilgoldC18,AccucoreaQ和ZORBAXRX-C8上不保留,在死时间出峰。在KinetexF5上保留较差,出峰时间0.94min,且峰形极差;在HypersilGOLDHILIC色谱柱上能够得到峰形尖锐的色谱峰。这是因为左旋肉碱为小分子极性化合物,在弱极性C18和C8填料的反相色谱柱上不保留。亲水作用色谱(HILIC)采用极性固定相,有机溶剂-水相缓冲液为流动相,能有效地保留反相色谱中保留不完全或不保留的强极性样品,并具有良好的分离效果[18]。

2.2流动相的选择

实验中考察了甲醇和水、乙腈和水、乙腈和乙酸铵溶液(含V/V0.15%甲酸)作为流动相时左旋肉碱在HypersilGOLDHILIC色谱柱的洗脱分离情况。结果表明:使用甲醇和水作为流动相洗脱时,保留时间0.27min,峰形扩散严重,响应很低;使用乙腈和和水作为流动相洗脱时,保留时间合理,但峰形拖尾严重;使用乙腈和乙酸铵(含V/V0.15%甲酸)溶液作为流动相洗脱时,峰形尖锐,响应明显提高,对称性增强。这是由于对HILIC色谱,甲醇的洗脱能力强于乙腈,且甲醇增加了分离的不确定性和较差的峰形[18]。因此在HILIC中一般采用乙腈-水作为流动相。水相中加入一定比例的乙酸铵和甲酸,可以提高离子化效率,改善峰形。故选用乙腈和乙酸铵(含V/V0.15%甲酸)溶液作为流动相进行梯度洗脱。标准溶液的HILIC-MS/MS谱图见图1。

图1左旋肉碱标准溶液(10ng/mL)的HILIC-MS/MS谱图下载原图

2.3质谱条件的确定

将1.0μg/mL的标准溶液通过蠕动泵注入质谱仪,通过优化去簇电压、碰撞能等参数,确定定性离子对为m/z162.0>85.0和m/z162.0>103.0,m/z162.0>103.0为定量离子对。

2.4样品前处理条件的确定

左旋肉碱易溶于水,所以本实验中采用水作为提取剂。考察水、0.2mol/L盐酸溶液、0.2%乙酸溶液的提取结果,发现测试结果无差别,所以采用超纯水作为提取剂直接提取。

由于左旋肉碱广泛分布于自然界,是生物体的基本成分。它在植物性饲料干物质中的含量要低于其在动物性饲料中的含量,但都在几～几百mg/kg数量级范围[4]。由于质谱的灵敏度高,为防止对质谱造成污染,同时为降低基质效应和保证测试液落在线性范围内,对提取液进行了200倍稀释后上机测试。

2.5基质效应

本方法为外标法,采用了稀释和减小进样量的方法来减小基质效应。由于左旋肉碱天然存在,无法获得饲料空白样品。本文取适量已知含量的稀释前提取液,添加一定量(体积尽可能小)的标准溶液和适量超纯水,使得最终得到的溶液中提取液稀释200倍,且添加浓度和原浓度保持基本相当。通过上机测试,由标准曲线给出提取液添加标准溶液前后左旋肉碱的含量。通过比较添加标准溶液前后左旋肉碱的含量变化来考察基质效应。实验中利用三种饲料考察了基质效应,结果见表1。基质效应=1-[ρ2/(ρ0+ρ1)]×100%。基质抑制呈现鳖饲料>鲫鱼饲料>锦鲤饲料的现象,与饲料中动物源性成分的含量一致。由于基质抑制<20%,且回收率>75%,见表2,故本测定方法忽略基质效应。

表1渔用配合饲料上机测试液的基质效应

2.6标准溶液的配制、标准曲线和检出限

用十万分之一的电子天平称取适量标准品,用超纯水溶解并定容,配制成100μg/mL的储备液,用超纯水逐级稀释成0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50、100ng/mL的标准系列,按浓度由低到高进LC-MS/MS测试,以左旋肉碱定量离子对m/z162.0>103.0的峰面积y对质量浓度x做标准曲线,得到线性方程y=6.46926x104x+35475.1,相关系数r=0.99973。根据鳖饲料、鲫鱼饲料和锦鲤饲料中左旋肉碱的信噪比,得出检出限为0.5μg/kg,定量限为1.5μg/kg。由于不同试样中所含的左旋肉碱含量水平有差异,如果测定结果超出了本方法的线性范围,需对样品溶液稀释后再测定。

2.7精密度和回收率

称取鳖饲料、鲫鱼饲料、锦鲤饲料三种饲料样品各12份,6份做本底,6份做标准溶液添加。按照本文建立的方法进行前处理和测定,考查方法的回收率和精密度,结果见表2。

表2渔用配合饲料中左旋肉碱的加标回收率和精密度(n=6)

2.8实际样品的测定

用本文建立的实验方法对客户的6份样品进行测定,测定值分别为562、51、168、360、466、288mg/kg,与客户预期值一致。实际样品的色谱图见图2。

3、结论

本研究建立了亲水作用色谱-串联质谱法测定渔用配合饲料中左旋肉碱的分析方法。该方法前处理简单,精密度高、定性定量准确,适合于渔用配合饲料中左旋肉碱的准确定性定量。

图2实际样品的HILIC-MS/MS谱图下载原图

参考文献：

[3]李海军,邵庆均,聂月美.L-肉碱在水产动物中的应用[J].饲料工业,2006,27(10):56-58.

[4]胡梦红,王有基.新型水产饲料添加剂-左旋肉碱[J].现代渔业信息,2006,21(6):18-20.

[5]阿迪力江·阿布都热合曼.左旋肉碱在畜牧业生产中的应用研究[J].甘肃畜牧兽医,2015,45(11):39-40.