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DHA对鱼类细胞蛋白质代谢关键通路、糖代谢和脂代谢过程关键酶基因水平的影响

2020-05-23 663 上传者：管理员

摘要：选取斑马鱼肝脏细胞作为体外研究模型,通过蛋白质印记分析和实时荧光定量PCR实验技术,测定了DHA(二十二碳六烯酸)对细胞内蛋白质合成关键通路以及糖脂代谢关键酶基因的表达,主要阐明了DHA对鱼类细胞蛋白质代谢关键通路、糖代谢和脂代谢过程关键酶基因水平的影响。

关键词：
Akt/mTOR
DHA
二十二碳六烯酸
斑马鱼肝脏细胞蛋白代谢
糖脂
蛋白质
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饲料占水产养殖总生产成本的一半以上,而蛋白质是影响鱼类生长性能和饲料成本的最重要也是最昂贵的营养素[1],肉食性鱼类倾向于把蛋白质作为供能物质,而不是脂质和碳水化合物。因此,为了满足鱼类的营养需求并节约成本,必须要提高饲料中蛋白质的利用效率[2]。有研究表明,饲料中蛋白质的利用效率与蛋白质水平和非蛋白质水平(糖和脂质等)的可用性有关。使用非蛋白质能源可以减少蛋白质对生产力的需求,并增加蛋白质对生长的利用,具有节约蛋白质的作用。

本研究中选择斑马鱼肝脏细胞作为实验模型,希望通过实验,能更好更深入地了解DHA对于鱼类的影响和相关机制。

1、材料方法

1.1斑马鱼肝脏细胞的培养

斑马鱼肝脏细胞系购买于中国典型培养物保藏中心,培养基基底配方:50%L-15,35%Eagle培养基,15%Ham'sF-12。另外添加:10%胎牛血清,0.15g/L碳酸氢钠,15mMHEPES,0.01mg/mLInsulin,50ng/mLbFGF,2mMGlutaMAX,28℃,无二氧化碳,无菌培养。

1.2细胞处理

细胞处理液的配制方法在已发表的文章的基础上进行了修改[6,7],在无血清培养基中加入1μMBSA和500μMDHA(Sigma,#D2534),摇匀等分保存在-80℃下。通过无血清培养基(含有1μMBSA)将DHA储备液稀释至0、2、5、10、20、40μM,即为处理液。在六孔板中培养细胞达到90%覆盖率,将细胞用24℃预热后的DPBS润洗两次,并用无血清培养基饥饿12h。饥饿后,将细胞用处理液孵育4h即可检测所需指标。

1.3蛋白质印记分析

将处理好的细胞用DPBS洗涤两次,并用RIPA缓冲液裂解,该缓冲液包含50mMTris,150mMNaCl,0.5%NP-40,0.1%SDS,1mMEDTA,蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Roche,#4693132001,#4906837001)。将裂解物在4℃下以12000g离心15min。接下来,用BCA蛋白质检测试剂盒(Beyotime,#P0011)收集上清以测量蛋白质浓度。蛋白质变性后通过SDS-PAGE分离,并转移至0.45m聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidenediuoridemembrane,PVDF;Millipore,#IPVH00010)。转移后,将膜用5%牛奶封闭并在一抗中于4℃孵育8h以上。然后将膜用二抗孵育,并用ECL试剂(Beyotime,#P1008)显影。使用的一抗如下:S6K1(CST,#9202),phospho-S6K1(Thr389;CST,#9205),Akt(CST,#9272),phospho-Akt(Ser473;CST,#9271),phospho-Akt(Thr308;CST,#9275),S6(CST,#2217),phospho-S6(Ser235/236;CST,#4856),4EBP1(CST,#9644),phospho-4EBP1(Thr37/46;CST,#2855),AMPKα(CST,#5831),phospho-AMPKα(Thr172;CST,#50081)。

1.4实时荧光定量PCR

处理后的细胞加1mLTrizol,使其充分裂解。12000g,4℃离心10min,取上清。加入1mL氯仿,冰上放置3min。12000g,4℃离心15min,取上清。加入1mL异丙醇,冰上放置10min。4℃,12000g离心10min,弃上清,RNA即沉于管底。按1mL75%乙醇悬浮沉淀。4℃,12000g离心10min,弃上清。打开离心管的盖子在冰上晾5～10min,干燥RNA样品。干燥完成后加入30～60uLDEPC水在冰上溶解RNA样品。取2uL样品用核酸蛋白检测仪(NANODROP2000,Thermo,USA)检测RNA浓度及其O.D值。按2μL6×buffer+1μL样品加样并吹打混匀。在配好的琼脂糖凝胶中点样并在TAEbuffer中电泳,电泳槽设置180V,10min,得到三条清晰的条带。

按照说明使用PrimeScript®RTReagentKitWithgDNAEraser(PerfectRealTime;TAKALA,Japan)进行反转录。反转录结束后使用SYBR®PrimixExTaqTM(PerfectRealTime;TAKALA,Japan)试剂盒进行荧光定量反应,定量仪器为Mastercyclereprealplex实时定量PCR仪(Eppendorf,Germany)。用于实时定量PCR的引物序列如表1。在确定实验处理对内参基因的表达没有影响后,计算各处理组相对于目的基因的表达量。

1.5数据处理

所有试验数据均用平均值±标准误(Mean±SEM)表示,使用SPSS19.0对数据进行分析和统计,首先通过ANOVA(one-wayanalysisofvariance)进行方差分析,若差异显著,再用Turkey’s作多重比较。当P<0.05时,差异显著。

表1用于实时荧光定量PCR的引物序列

2、结果

2.1DHA激活斑马鱼肝脏细胞Akt/mTOR通路

本研究检测了蛋白质合成有关的信号通路中几个关键激酶的活性。Akt/mTOR途径是调节蛋白质合成的重要通路之一[8]。我们首先检测了mTOR(targetofrapamycin,雷帕霉素靶蛋白)的上游激酶Akt(PKB;proteinkinaseB,蛋白激酶B)的磷酸化水平,结果表明DHA增加了phospho-AktThr308的水平。另外,作为mTOR的下游靶标,phospho-4EBP1Thr37/46,phospho-S6KThr389和phospho-S6Ser235/236的水平也随着DHA浓度的增加而增加。已知4EBP1和S6磷酸化水平的增加会促进细胞内蛋白质翻译及肽链的延长,这些结果表明,DHA可能通过Akt/mTOR通路促进蛋白质代谢(图1;P<0.05)。

图1DHA对Akt/mTOR信号通路的影响

2.2DHA对斑马鱼肝脏细胞脂质代谢的影响

本研究检测了参与脂质代谢的几个关键酶基因,结果如图2所示,DHA下调了脂质合成过程中的关键酶基因,包括HMGCS(hydroxy-3-methylglutaryl-CoAsynthase,3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶),SCD(stearoyl-CoAdesaturase,硬脂酰辅酶A去饱和酶),SREBP-1(sterolregulatoryelementbindingprotein1,固醇调控元件结合蛋白1)和FAS(fattyacidsynthetase,脂肪酸合成酶)(图2A;P<0.05)。参与脂质分解代谢的关键酶基因CPT1α(carnitinepalmitoyltransferase1,肉碱脂酰转移酶I)和ACOX(acylCoAoxidase,酰基辅酶A氧化酶)的水平下调(图2B;P<0.05)。这些结果表明DHA处理不仅抑制斑马鱼肝脏细胞脂质的合成,还抑制脂质的分解,总的来说是抑制肝脏细胞内的脂质代谢过程。

图2DHA对细胞脂质代谢的影响

2.3DHA对斑马鱼肝脏细胞能量代谢的影响

蛋白质印记分析结果显示DHA上调了AMPK(5’AMP-activatedproteinkinase,腺苷酸激活蛋白激酶)的磷酸化水平,激活了AMPK(图3A)。我们还检测了斑马鱼肝脏细胞内的糖代谢基因和TCA循环过程中的关键酶基因的表达。结果显示DHA不仅抑制了糖酵解相关酶GCK(glucokinase,葡萄糖激酶)的mRNA表达水平(图3B;P<0.05),还抑制了参与能量代谢的关键酶的表达水平,包括CS(citratesynthesis,柠檬酸盐合成酶)和IDH1(isocitratedehydrogenase1,异柠檬酸脱氢酶1)(图3C;P<0.05)。结果表明,DHA处理可能影响斑马鱼肝脏细胞能量代谢,降低细胞内能量水平。

图3DHA对细胞糖代谢和能量代谢代谢的影响(A)

3、讨论

我们的研究结果表明,DHA能激活斑马鱼肝脏细胞内调控蛋白质代谢的关键通路—Akt/mTOR信号通路。mTOR感知营养信号,并通过提高其底物S6K和4EBP1的磷酸化水平促进蛋白质的翻译过程[9]。phospho-S6KThr389,phospho-S6Ser235/236和phospho-4EBP1Thr37/46的水平随着DHA添加水平的提高而提高,说明DHA对mTOR通路具有激活作用。这与一些临床研究结果一致,例如,补充omega-3脂肪酸可以改善老年人的肌肉蛋白质量并预防肌肉减少症,并且激活一些信号转导途径关键酶的磷酸化水平,例如phospho-mTORSer2448和phospho-p70S6KThr389。Akt被认为是细胞生长不可或缺的控制节点,当被生长因子和营养状态变化激活时,Akt会上调mTOR信号传导[10]。我们的研究结果显示DHA上调了phospho-AktThr308水平。但是,另有研究结果证明DHA处理会抑制人乳腺癌细胞系MDA-MB-453的Akt磷酸化水平,认为这些多不饱和脂肪酸暂时干扰了细胞膜的双层结构,从而暂时破坏了细胞质Akt向质膜的募集或Akt与磷酸肌醇依赖激酶1(PDK1)之间的相遇[11]。然而,也有研究认为,DHA作为神经元细胞膜中含量较多的一种n-3PUFA,它通过增加细胞膜中磷脂酰丝氨酸的含量增强Akt的膜易位/活化[12]。不同的研究结果可能是由于实验材料的不同和处理时间的差异而引起的。所以,关于Akt是否是DHA对mTOR作用的上游激活分子仍需进一步研究证实。

本研究检测了斑马鱼肝脏细胞经过DHA处理后,参与脂质代谢、糖代谢和能量代谢基因的表达水平。结果显示,DHA处理后,主要的脂质合成基因HMGCS、SCD、SREBP-1、FAS和分解基因CPT1α、ACOX的水平都被下调。结果说明DHA处理可能抑制斑马鱼肝脏细胞的脂质代谢。糖酵解不仅为细胞代谢过程提供能量,还为细胞代谢提供各种代谢中间体。我们的结果显示,糖酵解基因GCK和参与能量代谢的关键酶(包括CS和IDH1)的水平随着DHA浓度的增加而降低。结果证明DHA处理可能影响斑马鱼肝脏细胞内的糖代谢和能量代谢。蛋白质印记分析结果显示phospho-AMPKThr172水平的上调也证明了这一定量结果,AMPK对机体的能量平衡具有重要作用,能感知机体的营养状态和激素水平,是细胞水平的能量感受器和调节器。一旦AMPK被激活就会降低细胞内多种消耗ATP的合成作用,促进多种合成ATP的分解作用,以此平衡机体ATP平衡,维持机体正常代谢所需要的能量[13]。

综上,本研究发现DHA处理激活斑马鱼肝脏细胞生长和蛋白合成相关通路,抑制斑马鱼肝脏细胞的脂质合成和分解过程以及能量代谢,总体来说,DHA处理可能通过改变细胞蛋白质代谢通路活性和糖代谢、脂代谢过程关键酶表达来影响细胞的整体代谢水平,这一发现有助于阐明脂肪酸与氨基酸协同作用对鱼类营养感知的影响机制,从而为鱼类科学高效养殖提供营养学理论基础。

侯宜颖,刘成栋,周慧慧,麦康森,何艮.二十二碳六烯酸对斑马鱼肝脏细胞蛋白代谢､脂代谢和能量代谢的影响[J].河北渔业,2020(05):1-5.

基金:国家重点研发计划(2018YFD0900400);国家自然科学基金(31772860)的支持.