首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 公共卫生论文 > 食品卫生论文 > 铁死亡在呕吐毒素诱导的L02细胞毒性中的作用研究

铁死亡在呕吐毒素诱导的L02细胞毒性中的作用研究

2024-10-03 33 上传者：管理员

摘要：目的探讨铁死亡在呕吐毒素（DON）诱导的L02细胞毒性中的作用。方法用1640培养基培养人正常肝细胞L02,用不同浓度的DON以及铁死亡抑制剂Fer-1处理细胞。荧光定量检测DON对铁死亡相关基因的表达变化，C11 BODIPY581/591荧光探针检测DON对细胞脂质ROS水平的影响，Ferro Orange荧光探针检测DON对细胞内Fe2+水平的影响，CCK-8法检测Fer-1对DON暴露下细胞活力的影响。结果 DON抑制铁死亡相关基因的表达，尤其是谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、溶质载体家族7成员11（SLC7A11）,促进转铁蛋白受体1（TFR1）的表达。增加细胞脂质活性氧（ROS）和细胞内Fe2+水平，诱导铁死亡，使细胞活力降低。Fer-1的预处理抑制了DON诱导的细胞铁死亡，提高了细胞的活力。结论 DON可导致L02细胞铁死亡，该过程与SLC7A11/GPX4通路抑制有关。

关键词：
加工食品
呕吐毒素
溶质载体家族7成员11
谷胱甘肽过氧化物酶4
铁死亡
加入收藏

呕吐毒素(DON)广泛分布于霉变的小麦、大麦、玉米等谷物和加工食品中，是粮谷中污染严重的霉菌毒素之一，影响着人类健康，已成为重大的食品安全问题[1-2]。肝脏是DON毒性作用的主要靶器官[3]。长期接触低浓度DON污染的食物可能导致人和动物肝损伤，造成食欲下降和生长发育迟缓[4-5]。因此，深入研究DON肝毒性的分子机制显得尤为重要，将为人类和动物DON肝疾病防控提供新思路。铁死亡(ferroptosis)是一种以胞内铁稳态失衡、活性氧(ROS)异常蓄积、诱导脂质过氧化的细胞死亡方式[6]。铁死亡的调控途径包括溶质载体家族7成员11(SLC7A11)/谷胱甘肽(GSH)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)经典途径、脂质代谢途径、铁代谢途径，形态上表现为线粒体萎缩、嵴减少或消失、线粒体膜密度增加、线粒体外膜破裂等。已有研究[7-8]表明，DON导致人正常肝细胞(L02)生长抑制和活力降低，然而，铁死亡在其中的作用尚不清楚。因此，本研究将探讨铁死亡在DON诱导的L02细胞毒性中的作用机制。

1、材料与方法

1.1实验材料

DON(HY-N6684)和Fer-1(HY-100579)购自MedChemExpress公司；L02细胞系购自通派(上海)生物科技有限公司；RPMI-1640培养基(SH30809.01B)、青链霉素双抗(SV30010)、胰蛋白酶-EDTA消化液(SH30042)购自HyClone公司；南美来源的胎牛血清(ST30-3302)购自PANTM Seratech公司；DMSO(D8418)购自美国Sigma公司；细胞冻存液(C40100)购自NCM Biotech; CCK-8、C11 BODIPY581/591探针购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；RNAiso Plus(9108Q)、Hiscript®ⅢRT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(R323)、ChamQ Universal SYBR qPCR Master(Q311)购自南京诺唯赞生物科技有限公司；Fe2+检测探针-FerroOrange(F374)购自同仁化学。

1.2实验方法

1.2.1 L02细胞的培养和处理

液氮冷冻的L02细胞放入37℃水浴锅中快速解冻，复苏，1000rpm离心4min,去除上清液，加1mL含有10%胎牛血清、1%抗生素(青链霉素)的RPMI-1640完全培养基，反复吹打成单个细胞后吸出，加到之前备好的细胞培养瓶中，于37℃、5%CO2培养箱中培养。复苏的细胞传代培养3～4次，用于后续的实验。

1.2.2药物配制

1mg DON标准品，加337.473μL DMSO,配制成1mmol/L母液，分装，于-20℃避光保存。

1.2.3荧光定量PCR

接种于24孔板中的细胞生长达到70%,换成基础培养基饥饿处理12h。根据前期文献[7-8],选择0、1.25、2.5、5μmol/L的DON处理12h。吸出培养基，用预冷的PBS清洗2次。每孔加入0.5mL的TRIzol试剂，收集细胞裂解液于1.5mL的无酶EP管中。将RNA分离、沉淀、清洗、溶解，于-80℃保存。取1μL总RNA样品，于Q3000分光光度计中检测RNA的浓度和A260/A280比值。

提取的总RNA样品严格按照Hiscript®ⅢRT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)反转录说明书进行操作。根据引物(见表1)和ChamQ Universal SYBR qPCR Master进行反应混合物的配制，然后分装于96孔板中，于伯乐CFX96 RT-PCR仪上进行热循环反应，设置程序为：95℃30s; 95℃10s; 60℃30s,共40个循环。热循环反应结束后，分析各个基因的扩增和溶解曲线。

表1 qPCR的引物序列

1.2.4单独DON处理细胞内Fe2+的检测

当96孔板中的细胞生长达到50%时，换为基础培养基继续培养12h,加不同浓度(0、1.25、2.5、5μmol/L)的DON处理12h。基础培养基洗涤细胞3次。加入浓度为1μmol/L的FerroOrange荧光探针工作液，避光于37℃孵育30min,在荧光显微镜下观察并采集图像。

1.2.5单独DON处理细胞脂质ROS的检测

细胞分组及处理同1.2.4。加入基础培养基配制的C11 BODIPY581/591荧光探针(10μmol/L),避光于37℃孵育1h。PBS清洗细胞2次，去除多余的染料。利用荧光显微镜，收集图像并分析。

1.2.6 Fer-1联合DON处理细胞后Fe2+的检测

当96孔板中的细胞生长达到50%时，换为基础培养基继续培养12h, Fer-1组和DON+Fer-1组加入10μmol/L的Fer-1预处理2h,紧接着DON组和DON+Fer-1组加5μmol/L的DON继续孵育12h,并设置空白对照组(Control组)。后续操作同1.2.4。

1.2.7 Fer-1联合DON处理细胞后脂质ROS的检测

细胞分组及处理同1.2.6,后续操作同1.2.5。

1.2.8 CCK-8实验

接种于96孔板中的细胞生长达到70%,换为RPMI-1640基础培养基饥饿处理12h,细胞分组同1.2.6。每孔加入10μL CCK-8溶液，在培养箱内继续孵育1h。使用酶标仪在450nm波长处测定吸光度值，根据试剂说明书的公式计算细胞活力。

1.3统计学方法

采用Graphpad prism 7.0统计软件绘图，采用SPSS 18.0进行统计学分析，多组的组间差异采用单因素方差分析(One Way ANOVA),两组之间的差异采用t检验，每次实验至少设置3个重复孔。以P<0.05表示差异具有显著性意义。

2、结果

2.1 DON对铁死亡相关基因表达的影响

荧光定量PCR的结果如图1,与对照组相比，铁死亡负调控基因GPX4的表达随DON浓度的升高而降低(P<0.05)。重要的是，DON抑制铁死亡上游关键调节因子SLC7A11的表达。DON暴露下，铁死亡其他相关基因如NAD(P)H∶醌氧化还原酶1(NQO1)、血红素氧合酶1(HO-1)的表达显著降低(P<0.05)。在1.25和2.5μmol/L的DON处理下，谷胱甘肽合成限速酶(GCLC)基因的表达也显著下降(P<0.05)。转铁蛋白受体1(TFR1)的丰度增加是铁死亡的标志，由图1可见，TFR1的表达在DON处理后显著增加(P<0.05)。这些结果表明，GPX4、SLC7A11可能是DON导致细胞铁死亡的关键蛋白。

图1 DON对铁死亡相关基因表达的影响

与对照组相比，**P<0.01,n=3。

2.2 DON提高细胞内Fe2+的水平

为了进一步证明DON所致L02铁死亡，测定了细胞内Fe2+水平。如图2所示，与对照组相比，DON浓度依赖性地增加细胞红色荧光的强度，说明细胞内Fe2+水平增加，表明DON诱导细胞铁死亡的发生。

图2 DON对细胞内Fe2+水平的影响

2.3 DON导致L02细胞脂质过氧化

C11 BODIPY581/591荧光探针染色后，发生铁死亡的细胞会由红色荧光迁移为绿色荧光，如图3所示。与对照组相比，随着DON浓度的增加，细胞红色荧光不断变弱，绿色荧光不断增强，说明细胞提高了脂质ROS水平，诱导细胞铁死亡。

图3 DON对细胞脂质ROS水平的影响

2.4 Fer-1抑制DON诱导的细胞游离Fe2+水平升高

为了验证铁死亡是DON诱导L02细胞毒性的表现形式之一，采用铁死亡抑制剂Fer-1预处理L02细胞，首先检测细胞游离Fe2+的水平。如图4所示，与对照组相比，DON显著提高细胞游离Fe2+水平(P<0.05),从而导致细胞铁死亡。而与DON处理相比，Fer-1的预处理显著降低Fe2+水平(P<0.05),从而抑制了DON造成的细胞铁死亡。

图4 Fer-1降低DON暴露下的细胞游离Fe2+的水平

2.5 Fer-1抑制DON诱导的细胞脂质ROS水平升高

为了进一步证明铁死亡是DON诱导L02细胞毒性，采用铁死亡抑制剂Fer-1预处理L02细胞，并检测脂质ROS和细胞活力水平。如图5所示，与对照组相比，DON显著提高细胞脂质ROS水平(P<0.05),从而导致细胞铁死亡，活力下降。而与DON处理相比，Fer-1的预处理显著降低细胞脂质ROS水平(P<0.05),从而抑制了DON造成的细胞铁死亡，增加了细胞活力。

图5 Fer-1降低DON暴露下的细胞脂质ROS水平和提高细胞活力

3、讨论

以往的研究[9-10]表明，DON主要通过激活死亡受体途径，氧化应激、炎症、凋亡和自噬等机制，导致肝细胞毒性，促进肝细胞凋亡。铁死亡不同于细胞凋亡、坏死、焦亡、自噬等，而是一种铁依赖性的细胞死亡方式。本研究表明，DON可通过提高细胞脂质过氧化和Fe2+的水平，从而诱发细胞铁死亡，最终导致细胞活力降低。这表明铁死亡是DON诱导肝细胞毒性的机制之一。

DON通过抑制SLC7A11和GPX4的表达，导致细胞铁死亡。胱氨酸/谷氨酸转运体系统(System Xc-/GSH/GPX4)是调节铁死亡的经典通路[11]。Xc-系统由轻链SLC7A11和重链溶质载体家族3成员2(SLC3A2)组成，其中SLC7A11参与胱氨酸的胞外摄取和谷氨酸释放，促进GSH的合成，维持GPX4的活性，最终防止细胞因脂质过氧化而死亡[12-13]。本研究结果表明，DON可降低GPX4、SLC7A11以及GCLC、NQO1和HO-1的表达，增加TFR1的表达和脂质ROS水平，导致生成和细胞内Fe2+超载，最终造成细胞铁死亡。

总之，DON通过抑制铁死亡关键蛋白GPX4和SLC7A11以及抗氧化蛋白GCLC、NQO1和HO-1的表达，增加TFR1的表达，诱导脂质ROS生成以及Fe2+过载，导致脂质过氧化和L02细胞铁死亡。本课题组将进一步研究DON诱导细胞铁死亡的分子机制，以及寻找中药靶向铁死亡来防控真菌毒素的细胞毒性。

基金资助:湖北科技学院2022年度医学科研专项(2022YKY17); 湖北科技学院博士启动基金项目(BK202315); 湖北省青年基金(2023AFB537);

文章来源:宋晨晨,王威,尧青,等.铁死亡在呕吐毒素诱导的L02细胞毒性中的作用研究[J].湖北科技学院学报(医学版),2024,38(05):414-417.