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小檗碱减轻慢性肾衰竭大鼠的肾脏损伤

2024-11-29 28 上传者：管理员

摘要：目的探讨小檗碱(BBR)对慢性肾衰竭(CRF)大鼠的作用及可能的机制。方法将大鼠随机分为假手术(sham)组、慢性肾衰竭模型(model)组(切除5/6肾建立CRF大鼠模型)、小檗碱(BBR)治疗组、尿毒清颗粒(UCG)治疗组，每组10只。用全自动生化仪检测各组大鼠的肾功能指标；ELISA法检测MMP-2、MMP-9水平；PAS、Masson染色法观察肾组织纤维化程度；免疫组织化学方法检测肾脏组织中NF-κB p65、IL-6的表达；Western blot检测肾脏组织纤维化相关蛋白及TGF-β1/ERK信号通路蛋白的表达。结果与假手术组相比，模型组大鼠肾功能及肾组织病理学损害显著增加，BBR可以改善CRF大鼠的肾功能及肾组织病理学损害。与假手术组相比，模型组大鼠血清中MMP-2、MMP-9水平明显下降(P<0.05),IL-6、NF-κB p65表达上调(P<0.05),FN、α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、TGF-β1、p-ERK1/2蛋白的表达水平均上调(P<0.05),而BBR治疗显著逆转了这些分子的表达(P<0.05)。结论 BBR可能通过抑制TGF-β1/ERK1/2通路改善肾脏炎症和纤维化，发挥对CRF大鼠的保护作用。

关键词：
BBR
CRF
小檗碱
慢性肾衰竭
纤维化
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慢性肾衰竭(chronic renal failure, CRF)是多种慢性肾脏病的最终结局，目前已成为中国重要的公共卫生问题[1]。据统计，中国慢性肾衰竭的患病率和发病率约10.8%和0.3%,并呈逐年上升的趋势[2]。随着患者病情的进一步发展，肾脏替代治疗不可避免，自1990年到2017 年全球透析和肾移植分别增加43.1%和34.4%,造成严重的经济与社会负担[2]。肾脏间质纤维化(renal interstital fibrosis, RIF)是所有类型的肾脏疾病向终末期肾病(end stage renal disease, ESRD)发展的必然途径，其严重程度的不同反映了疾病的发展过程[3]。RIF本质是细胞外基质(extracellular matrix, ECM)成分的病理性堆积[4]。在肾脏纤维化的过程中，有很多细胞因子起着重要的调节作用。研究证实，TGF-β是一个重要的纤维化因素，他的下游因子细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)在诱发RIF起到关键作用[5]。小檗碱(berberine, BBR)是一种异喹啉生物碱。国内外研究发现，BBR可通过抗氧化、抗凋亡以及减轻内质网应激保护足细胞，减轻RIF[6]。但尚缺乏BBR对5/6肾切除所致的CRF大鼠RIF方面进行系统研究。因此，本研究将通过5/6肾切除造模方法建立CRF大鼠模型，探讨BBR对CRF大鼠的作用及可能机制，从而为CRF的治疗提供新的方法。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 大鼠：

40只SPF级6～8周SD大鼠、雄性、体质量为160～220 g, 济南朋悦有限公司[动物许可证号：SCXK(鲁)2019003],饲养于济宁医学院实验动物中心。

1.1.2 主要试剂：

小檗碱(上海源叶生物科技有限公司);尿毒清颗粒(康臣药业有限责任公司);TGF-β1抗体、FN抗体、胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)抗体、α-SMA抗体、Collagen-Ⅰ抗体、Collagen-Ⅲ抗体、IL-6抗体和NF-κB p65抗体(Abcam公司);BCA蛋白浓度测定试剂盒、Loading buffer(Biosharp公司);ELISA试剂盒(江苏酶免实业有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组和干预：

切除5/6肾法[8]复制CRF模型，尾静脉血检测血清肌酐(serum creatin-ine, Scr)、尿素氮(blood urea nitrogen, Bun)水平，较对假手术组显著升高，则表明造模成功。CRF大鼠造模成功率约为60%。将40只大鼠随机分为假手术(sham)组、慢性肾衰模型(model)组、小檗碱(berberine, BBR)治疗组(每天灌胃给予300 mg/kg BBR[7])、尿毒清颗粒(uremic clearance granules, UCG)组(每天给予2.2 g/kg的尿毒清溶液),每组10只。灌胃8周后，用戊巴比妥钠麻醉大鼠，从心脏取血，用颈椎脱位法杀死大鼠。最后，对所有大鼠进行解剖和取样。

1.2.2 生化指标的检测：

通过心脏穿刺收集6～10 mL的血液，放入含有抗凝血剂的试管中，以3 000 r/min离心15 min。收集大鼠血清，用全自动生化分析仪检测血清样本中Scr、Bun的水平。

1.2.3 ELISA法检测血清中MMP-2、MMP-9的水平：

用ELISA法按照试剂盒说明书操作检测MMP-2、MMP-9水平。

1.2.4 肾脏组织的病理学检查：

肾脏组织用4%多聚甲醛固定，乙醇脱水，石蜡包埋切片，然后进行PAS染色和MASSON染色[10],通过光学显微镜观察肾组织纤维化程度。

1.2.5 免疫组织化学染色检测肾组织NF-κB p65、IL-6蛋白表达：

石蜡切片脱蜡后，用3%过氧化氢溶液培养10 min, 85 ℃进行抗原修复，再用10% BSA溶液封闭20 min; 然后加入NF-κB p65和IL-6兔单克隆抗体4 ℃孵育过夜；加二抗后室温孵育30 min, 滴加DAB显色液。在光学显微镜下采取双盲法判定。

1.2.6 Western blot法检测肾组织蛋白表达情况：

为提取肾组织及细胞内的蛋白质，本研究采用蛋白质裂解缓冲液裂解细胞。随后，运用BCA试剂盒进行蛋白定量。经由电泳技术分离的蛋白质，进一步被转移至PVDF膜。膜在室温下用5%脱脂牛奶封闭1 h, 以阻断非特异性结合。继而，一抗在4 ℃条件下孵育过夜，次日则使用标记有HRP的相应小鼠或兔源二抗(稀释比例为1∶10 000)进行孵育。最终，借助超敏ECL化学发光法获得图像，并应用ImageJ软件定量分析条带。

1.3 统计学分析

采用SPSS 26.0进行数据分析，数据以均值±标准差

表示，两组间比较采用t检验。

2、结果

2.1 各组大鼠的血清肌酐、尿素氮水平

模型组的血清肌酐和尿素氮的水平高于假手术组(P<0.05);与模型组相比，BBR组、UCG组的血清肌酐和尿素氮水平均显著降低(P<0.05)(表1)。

表1 各组大鼠血肌酐及尿素氮水平的比较

2.2 大鼠血清中 MMP-2、MMP-9水平

模型组血清中MMP-2、MMP-9水平明显低于假手术组(P<0.05);BBR组与UCG组血清中MMP-2、MMP-9水平明显高于模型组(P<0.05)(表2)。

2.3 大鼠肾组织病理学结果

PAS染色中假手术组肾小管、肾小球和肾间质显示出规则的细胞排列和正常的结构。模型组中肾组织严重受损，肾间质有较多炎性细胞浸润，纤维组织增生。肾小管结构严重受损。经过药物治疗后，BBR组和UCG组中的上述病变较model组减轻(图1)。

表2 各组大鼠血清中MMP-2、MMP-9水平比较

Masson染色中胶原纤维呈蓝色，颜色覆盖范围越广，颜色越深，代表纤维化病变越重。与假手术组比较，模型组大鼠肾脏胶原纤维大量沉积；与模型组比较，BBR组、UCG组大鼠各肾组织中胶原纤维沉积情况有不同程度改善(图2)。

2.4 大鼠肾脏组织IL-6和NF-κB p65的表达水平

模型组肾小管有棕黄色细胞，肾小球内着色较浅，可见浅黄色细胞；与模型组相比，BBR组、UCG组着色较浅(图3, 4)。通过评分可以得出，与假手术组比较，模型组IL-6、NF-κB p65表达上调(P<0.05);与模型组相比，BBR组、UCG组IL-6、NF-κB p65表达下调(P<0.05)(表3)。

2.5 肾脏纤维化相关蛋白及TGF-β1/ERK信号通路蛋白的表达

与假手术组相比，模型组肾脏纤维化相关蛋白FN、α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ明显升高(P<0.05);与模型组相比，BBR组和UCG组FN、α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的蛋白表达显著降低(P<0.05)。与假手术组相比，模型组TGF-β1、p-ERK1/2蛋白表达水平显著上调(P<0.05)。BBR组和UCG组TGF-β1、p-ERK1/2的蛋白表达量较model组明显降低(P<0.05)(图5)。

3、讨论

BBR是中药黄连中的主要有效物质，具有多种药理作用，对心脑血管系统、肾脏、肝脏等器官均可以起到保护作用[6]。研究证实， BBR对于实验性肝纤维化具有保护作用[5],然而其对CRF大鼠肾脏保护作用及具体机制尚未完全阐明。因此，本研究采用5/6肾切除法成功制作CRF大鼠模型，研究结果证实CRF大鼠在BBR干预下，Scr和Bun水平明显降低，肾组织病理变化减轻，提示BBR对CRF大鼠具有肾脏保护作用，这与之前相关文献报道结果相似。

图1 各组大鼠肾组织PAS染色

图2 各组大鼠肾组织Masson染色

CRF的发病与肾间质纤维化(renal interstital fibrosis, RIF)密切相关，RIF是导致肾脏结构和功能障碍的主要原因[9]。肾脏炎性反应是形成RIF的主要驱动因素[10]。NF-κB信号途径是免疫炎性反应主要的信号途径，直接参与RIF的发生发展[11]。IL-6是一种具有广泛生物学效应的细胞因子，它可刺激肾小球系膜细胞增生，导致(extracellular matrix, ECM)的增多，对RIF的形成有重要意义[12]。肾组织ECM包括Col-Ⅰ、Col-Ⅲ等，与RIF的发生发展关系十分密切。特异性表达α-SMA的肌成纤维细胞(myofibroblast, MFB)是产生ECM的主要细胞[13]。本研究结果表明，BBR干预后可显著降低CRF大鼠中IL-6、NF-κB p65、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA的表达水平，提示 BBR 可抑制RIF及其炎性反应。

图3 免疫组化检测肾组织NF-κB p65表达

图4 免疫组化检测肾组织IL-6表达

表3 IL-6、NF-κBp65在大鼠肾组织中的表达

TGF-β1是重要促纤维化介质，其作用直接表现在刺激ECM的产生，同时它通过增加基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMPs)活性和减少MMPs活性来抑制ECM的降解[5]。而MMPs有助于ECM的降解，尤其是MMPs家族的MMP-2和MMP-9,它们与RIF的关系最为密切[14]。本实验结果表明BBR干预后可以升高MMP-2、MMP-9水平，促进ECM的降解，纤维化相关指标部分恢复，减轻了RIF。

TGF-β1可通过ERK1/2途径，导致肾小管细胞胶原沉积和RIF[15]。ERK是较大的丝裂原活化蛋白激酶家族的成员。磷酸化后ERK参与了细胞核内外的信号转导，在RIF过程中发挥重要作用，是TGF-β1诱导肾小管上皮细胞发生EMT的重要通路之一[15]。本研究发现CRF大鼠肾脏中p-ERK1/2表达水平升高，BBR治疗后p-ERK1/2表达水平下降，说明BBR可能抑制了TGF-β1/ ERK 1/2信号通路。

图5 大鼠肾组织TGF-β1、FN、α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、ERK、p-ERK1/2蛋白表达

综上所述，本实验通过观察BBR对CRF大鼠RIF的影响，发现BBR可以从多个靶点减轻CRF大鼠RIF,其机制可能是BBR通过抑制TGF-β1/ERK1/2通路减少ECM的产生，减轻炎性反应；同时升高MMP-2、MMP-9水平促进ECM的降解，减轻RIF,从而对CRF大鼠起到肾脏保护作用。

参考文献:

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基金资助:济宁市重点研发计划项目(2020YXNS028);

文章来源:谢丹丹,李含,王白菊,等.小檗碱减轻慢性肾衰竭大鼠的肾脏损伤[J].基础医学与临床,2024,44(12):1663-1669.