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苯酚降解复合菌群的构建及其降解动力学

2024-06-20 49 上传者：管理员

摘要：为提高废水中苯酚的降解效率，利用微生物之间的协同作用将3种菌株进行复配，构建出能有效降解苯酚的复合菌群。首先，通过正交试验优化不同菌株的复配比。随后，探究复合菌群对初始质量浓度范围为400～1 400 mg/L的苯酚的降解过程，并首次提出选用Three-half-order模型描述复合菌群对苯酚降解的动力学。结果表明：相比单株菌，优化复配比后的复合菌群能够将苯酚的去除率提高至99.85%。相比一级动力学模型，Three-half-order模型对不同初始质量浓度苯酚的降解过程的预测更加准确。对苯酚的生物降解过程进行动力学建模，有助于了解苯酚降解过程中苯酚质量浓度变化的规律。

关键词：
动力学
复合菌群
污水处理
生物降解
苯酚
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苯酚及其衍生物经常出现在炼油、制造、制药、焦化等相关行业的废水中[1]。苯酚的水溶性使其成为一种非常重要的环境污染物，未经处理就排放到环境中，对动植物都是有害的[2]。目前，废水中苯酚的处理方法包括吸附法[3]、蒸馏法[4]、氧化法[5]、生物法[6]等。与价格昂贵且易于形成二次有毒物质的物理化学方法相比，生物法是最可持续、最具成本效益的清洁技术[7]。苯酚的微生物降解是20世纪下半叶科学研究的热点。目前，已报道的可降解苯酚的细菌包括假单胞菌、不动杆菌、镰刀菌等。好氧条件下，微生物降解苯酚的一种典型途径是先由苯酚羟基化酶氧化成儿茶酚。随后，儿茶酚通过芳香环的两种不同方向的裂解被氧化。一种是由儿茶酚1,2-双加氧酶催化的邻位裂解，依次生成内酯和β-酮基己二酸；另一种是由儿茶酚2,3-双加氧酶催化的间位裂解，依次生成2-羟基黏酸和2-氧代戊烯酸。最后，儿茶酚被氧化裂解的产物进入三羧酸循环，最终生成二氧化碳和水。Kumar等[8]研究了恶臭假单胞菌在碱性盐介质中对苯酚的降解，发现该菌株降解初始质量浓度为1 000 mg/L的苯酚需要162 h。然而，单株微生物对底物的降解能力有限。可利用微生物之间的协同作用将不同微生物进行复配，构建复合菌群以提高苯酚的降解效率。另外，生物法降解苯酚过程伴随着微生物的生长、底物的消耗和产物的形成等复杂降解机理，因此，很难通过理论模型定量描述生物降解过程中苯酚质量浓度的变化。降解动力学模型通过建立反应物浓度与生物量浓度的半经验关系式，可帮助生物工程师更好地描述苯酚的生物降解过程[9]。

国内研究者探究微生物降解底物的动力学行为热衷于选用Monod[10]、Haldane[11]、一级动力学[12]等模型。然而，这些模型本身的局限性限制了它们在一些领域的应用。通过Monod和Haldane模型能获得微生物的比生长速率或底物的比降解速率等动力学参数，Monod模型适用于底物对微生物无抑制作用或抑制作用较小的情况，而对Haldane模型进行参数回归的过程需知道生物量浓度(X)随降解时间的变化，这无疑增大了模型的实验验证难度。一级动力学模型虽然常用来描述降解速率与底物浓度之间的关系，但该模型并没有考虑微生物生长对底物降解的影响。Three-half-order模型的提出，最初应用于描述土壤中碳质底物的矿化动力学过程[13]。微生物在土壤中的生长受到基质和养分扩散的限制。这与在生物降解苯酚过程中，微生物的生长受到有毒底物的抑制作用相似。所以，尝试将该模型应用于描述构建的复合菌群降解苯酚的动力学过程。本工作选用的Three-half-order模型中仅涉及底物浓度和降解时间两个变量，模型拟合过程不需要知道生物量浓度(X)的变化。因此，该模型仅通过底物浓度即可构建微生物降解苯酚动力学模型。

本文将3种菌株进行复配，构建出能有效降解苯酚的复合菌群。随后，探究复合菌群对不同初始质量浓度苯酚的生物降解。选用Three-half-order模型描述苯酚的生物降解过程，并通过实验数据对模型参数进行拟合以获得模型中参数的估计值。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种来源

实验室保存菌株：Acinetobacter sp. L1(菌L1),Rhodococcus sp. H(菌H)和Rhodococcus sp. J(菌J)。

1.1.2培养基的制备

富集培养基(1 L):牛肉膏5 g,氯化钠5 g,蛋白胨10 g, pH 7.0左右。固体培养基是在液体培养基中加入2%的琼脂。

无机盐培养基(1 L):K2HPO4 1 g, KH2PO4 0.5 g, MgSO4 0.2 g, NaCl 1 g, NH4Cl 1.34 g, pH 7.0左右。在无机盐培养基中加入一定量的苯酚，即可配制成以苯酚为唯一碳源的选择培养基。

1.2方法

1.2.1苯酚降解率的测定

在苯酚生物降解过程中，取某一时刻的反应溶液1 mL,将待测溶液离心以沉淀溶液中的细菌。用紫外分光光度计检测不同时刻待测溶液上清液的OD270值，根据OD270值和苯酚质量浓度的标准曲线即可获得不同时刻培养基中的剩余苯酚质量浓度[14]。苯酚降解率的计算如公式(1)所示：

降解率=[(C0-Ct)/C0]×100% (1)

式中：C0为初始苯酚质量浓度；Ct为t时刻剩余苯酚质量浓度。

1.2.2复合菌群的构建

将3种菌株分别接种到富集培养基中培养。待培养物生长到对数生长期时，用灭过菌的去离子水洗涤并重悬菌体以去除培养物上附着的富集培养基，调节OD600值至1.67作为接种液。

在250 mL烧瓶中加入100 mL无机盐培养基和50 mg苯酚配制成苯酚质量浓度为500 mg/L的选择培养基。此时，选择培养基中苯酚为唯一碳源。

实验中，3种菌株的初始OD600值均为1.67,菌种总投加量控制为3%(体积比),即3 mL菌种/100 mL培养基。将3种单独菌株(菌L1、菌H和菌J各3 mL)、任意两种菌株等比例混合(菌L1和菌H各1.5 mL混合、菌L1和菌J各1.5 mL混合、菌H和菌J各1.5 mL混合)和3种菌株等比例混合(菌L1、菌H和菌J各1 mL混合)分别投加到选择培养基中。共构建7组实验，每组3个平行样。在30℃、180 r/min摇床恒温培养24 h,根据苯酚降解率，确定最佳菌株组合。

复合菌群构建过程中以最佳菌株组合为基础，通过正交试验[15]将各种菌株之间按照不同比例组合，各种组合中菌株总的投加量仍控制为3%(体积比),即3 mL菌种/100 mL培养基。将各种组合的菌株分别投加到选择培养基中。在30℃、180 r/min摇床恒温培养24 h,根据苯酚降解率，筛选高效复合菌群。

1.2.3复合菌群降解苯酚动力学

用筛选得到的复合菌群降解初始质量浓度分别为400、600、800、1 000、1 200、1 400 mg/L的苯酚。复合菌群投加量控制为3%(体积比),即3 mL。定时取样检测剩余苯酚质量浓度。分别选用一级动力学模型[式(2)]和Three-half-order模型[16][式(3)]描述苯酚的降解过程。为了更直观地观察苯酚质量浓度随时间的变化，可将式(3)变换成式(4)。

式中：t为时间，h; S0为初始苯酚质量浓度，mg/L;St为t时刻苯酚剩余质量浓度，mg/L;k和k1均为一阶速率常数；k2为二阶速率常数。

2、结果与分析

2.1复合菌群的构建

图1展示了L1、H、J菌株单独存在和相互组合情况下24 h内对500 mg/L苯酚的降解率。可以看出，当3种菌株单独存在时对苯酚的降解能力有限。尤其是L1菌，在24 h内对苯酚的降解几乎为零，H菌降解效果最好，也只有70%。当把3种菌株相互组合时，降解效果更好。如将L1、H两种菌株组合，降解率可提高至90%,当3种菌株组合时，降解率高达95%。因此，将L1、H、J菌株共同降解苯酚视为降解苯酚的最佳菌种组合。通过对各组菌种组合之间进行显著性差异分析可以看出，除J菌株单独存在时与L1菌株和J菌株组合时之间无显著性差异(P>0.05)外，其他菌种组合之间均存在显著性差异(P<0.05)。这说明不同菌种的组合对苯酚降解是有影响的。

通过正交实验对L1、H、J菌株进行复配[3种菌株的初始OD600值均为1.67,种子总投加量控制为3%(体积比),即3 mL菌种/100 mL培养基。体积的复配比例水平为1、2、3,具体混合比例如表1]。构建了9组不同配比的复合菌群，每组3个平行样。结果如表1所示，当复合菌群之间的复配比为菌L1∶菌H∶菌J=3∶1∶3时，对苯酚的降解效率最低，仅为60%。当复合菌群之间的复配比为菌L1∶菌H∶菌J=2∶3∶3时，对苯酚的降解效率最高，可达到99.85%。复配影响因素主次大小为菌H>菌L1>菌J。

图1 3种菌株单独或相互组合降解苯酚效果对比

不同字母表示不同实验之间有显著性差异，相同字母表示不同实验之间无显著性差异。

表1正交结果

2.2复合菌群降解苯酚动力学

图2展示了构建的复合菌群对不同初始质量浓度苯酚的降解过程。苯酚完全降解需要的时间取决于苯酚的初始质量浓度。当初始质量浓度为400 mg/L时，完全降解苯酚需要25 h;当初始质量浓度为1 400 mg/L时，完全降解苯酚需要96 h。苯酚的降解过程可大致分为停滞期和活跃期两个阶段。由于苯酚的毒性会对微生物的生长产生抑制作用进而抑制苯酚的降解，且苯酚质量浓度越高，抑制作用越明显。因此，苯酚的降解初期表现为停滞期，且初始苯酚质量浓度越高，停滞期越长。当初始苯酚质量浓度由400 mg/L提高到1 400 mg/L时，停滞期也由2 h增加到了20 h。微生物在停滞期适应环境以后，细菌的生长速率会明显高于死亡速率，此时，微生物数量会快速增长。因此，苯酚的降解速率会大大提高，即出现了苯酚降解的活跃期。

图2复合菌群对不同初始质量浓度苯酚降解时间曲线

采用一级动力学模型[式(2)]和Three-half-order模型[式(4)]来描述苯酚降解动力学行为。若ln(S/S0)和时间t线性相关，则说明苯酚的降解过程符合一级动力学。图3和图4分别展示了一级动力学模型和Three-half-order模型对不同初始质量浓度苯酚降解活跃期的拟合。表2和表3分别展示了一级动力学模型和Three-half-order模型中参数的拟合结果。可以看出，对一级动力学模型，除了初始苯酚质量浓度为400 mg/L时，拟合的决定系数(R2)大于0.9,该模型对其他初始苯酚质量浓度的拟合效果均不理想。而Three-half-order模型对所有初始苯酚质量浓度拟合的决定系数(R2)均大于0.9,所以Three-half-order模型可用来描述苯酚的降解过程。

图3不同初始苯酚质量浓度下的一级动力学模型拟合结果

图4不同初始苯酚质量浓度下的Three-half-order模型拟合结果

表2不同初始苯酚质量浓度下的一级动力学模型回归参数

表3不同初始苯酚质量浓度下的Three-half-order模型回归参数

3、结论

将3种菌株：菌L1、菌H、菌J进行相互组合，获得菌群复配最佳比例为菌L1∶菌H∶菌J=2∶3∶3,复配影响因素主次大小为菌H>菌L1>菌J。付佳等[17]用分离得到的醋酸钙不动杆菌降解初始质量浓度为500 mg/L的苯酚，微生物接种量为13%。结果发现，经24 h处理，苯酚去除率为94.31%。而本文用构建的包含不动杆菌的复合菌群同样降解初始质量浓度为500 mg/L的苯酚，微生物接种量为3%,经24 h处理，苯酚的去除率为99.85%。通过对比，可以看出构建的复合菌群提高了苯酚的生物降解效率。这是微生物之间存在协同作用且各生物之间相互竞争苯酚作为碳源和能源的结果。

随后，探究了构建的复合菌群对不同浓度苯酚的降解效果。发现对初始质量浓度400～1 400 mg/L的苯酚，在降解活跃期苯酚的降解速率不断增大，这与Three-half-order模型所描述的曲线的趋势类似。所以，选用该模型对复合菌群降解苯酚过程进行动力学建模，并对模型中的参数进行了估算。对不同初始质量浓度苯酚下模型参数回归的结果表明，决定系数(R2)均大于0.9,说明Three-half-order模型可以有效描述苯酚的生物降解过程。生物法降解苯酚过程动力学建模可用于预测一定时间内污染物的残留量，预测将底物降低到一定浓度所需的时间并据此设计生物修复方案以将化学污染物去除达到设计浓度[18]。

参考文献:

[12]刘宏芳,张肇铭.沼泽红假单胞菌降解苯酚的动力学研究[J].科技情报开发与经济,2008(12):136-137.

[14]许文帅.固定化Rhodococcus sp.W7处理焦化废水的研究及应用[D].天津:天津科技大学,2021.

[15]蔡倩倩,冉新新,郭南南,等.苯酚高效降解复合菌的构建及应用研究[J].当代化工,2021,50(10):2398-2402.

[17]付佳,谌伦建,徐冰,等.模拟煤炭气化废水中苯酚的微生物降解[J].化工进展,2023,42(1):526-537.

基金资助:天津市科技计划项目(20YDTPJC01820);国家自然科学基金青年项目(22108204);

文章来源:杨宗政,刘伟萌,吴志国,等.苯酚降解复合菌群的构建及其降解动力学[J].生物学杂志,2024,41(03):98-102.