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HPLC指纹图谱分析竹节参茎叶化学成分的累积特征

2024-06-20 30 上传者：管理员

摘要：目的研究不同生长期竹节参茎叶中化学成分的累积变化规律。方法采用HPLC法测定不同生长期竹节参的茎叶，根据紫外光谱特征鉴别对应成分类型，计算相似度；运用聚类分析(HCA)、主成分分析(PCA)和偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)对竹节参茎叶进行模式识别分析；结合热图分析各类化学成分的累积变化规律。结果建立了竹节参茎叶的HPLC指纹图谱，标定了23个共有峰，对应化学成分类型主要为黄酮类和皂苷类，并指认了其中7个共有峰；22批样品的一致性较高；竹节参茎叶在不同生长期内的成分累积特征存在差异，4、5月份黄酮类成分积累最多，而皂苷类成分的累积量在6、7月份达最大值；通过HCA、PCA和PLS-DA可将不同生长期的竹节参茎叶完全区分开来，其中，有7个特征峰可作为不同生长期竹节参茎叶差异性的主要标志。结论竹节参茎叶含有丰富的黄酮类和皂苷类成分，HPLC指纹图谱结合化学计量学法能反映其生长期内次生代谢成分的动态累积变化。

关键词：
不同生长期
动态累积特征
化学模式识别
指纹图谱;
次生代谢产物
竹节参茎叶
高效液相色谱法
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五加科植物竹节参Panax japonicus C.A.Mey.的干燥根茎，1977年至今被收载于历版《中国药典》中，具有补虚强壮的功效，用于治疗病后虚弱[1]。竹节参原植物主要分布于北纬30度的云南、四川等高山地区[2]。作为药食同源的植物，竹节参被列入化妆品原料目录，且为保健食品“八峰氨基酸口服液”的重要原料[3]。随着市场需求增加，竹节参的野生资源大量减少，人工种植竹节参成为一种趋势[4]。一般人工栽培的竹节参需生长5年以上才可采收地下部位。在整个种植和采收过程中，每年产出竹节参茎叶的资源量巨大，因未有效利用，造成资源浪费。1978年版《湖北中草药志(一)》中记载了竹节参的茎与叶可作为参叶茶，但目前关于竹节参茎叶的研究报道较少。前期研究结合文献调研发现：竹节参茎叶含有人参皂苷Rc、Rg1和竹节参皂苷Ⅴ、Ⅳa及人参黄酮苷等成分，具有抗炎、镇痛的多种生物活性，是一种极具开发潜力的资源[5,6]。竹节参在3月出芽，4月长叶，5、6月为花期，7月为果期，8月后进入倒苗期。已知大量次生代谢产物的生成常出现在植物不同生长期内，并呈现出一定的动态积累变化规律[7]。目前，关于竹节参茎叶中皂苷类、黄酮类等次生代谢成分的动态积累变化未见报道。现选取4月至8月间同一产区的竹节参地上部分的茎叶为研究对象，建立其HPLC指纹图谱，综合分析竹节参茎叶不同生长期主要化学成分的动态积累变化，通过聚类分析、主成分分析和偏最小二乘法-判别分析等化学计量学方法，评价不同批次竹节参茎叶化学组成的相似性和差异性，筛选不同生长期内竹节参茎叶差异性的主要特征，以期为该药材茎叶的采收时间选择、质量等级评价及资源高效利用提供依据。

1、实验部分

1.1仪器与试药

Ultimate 3000高效液相色谱仪(美国Thermo Fisher)。22批样品(湖北恩施竹节参栽培基地，经鉴定为五加科植物竹节参Panax japonicas C.A.Mey.的茎叶，表1),水为超纯水；乙腈和磷酸为色谱纯；其余试剂为分析纯。

表1竹节参茎叶样品的信息

1.2方法与结果

1.2.1色谱条件

采用Zorbax SB-Phenyl色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5μm),流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸(B),洗脱梯度(0～7 min、5%A,7～13 min、5%～16%A,13～25 min、16%～21%A,25～32 min、21%～22%A,32～65 min、22%～47%A,65～71 min、47%～90%A,71～80 min、90%A),柱温30℃,检测波长205 nm,流速为1.0 mL·min-1,进样体积5μL。

1.2.2溶液的制备

取适量干燥的竹节参茎叶粗粉，置索氏提取器中，加100 mL二氯甲烷，加热回流至虹吸管中溶剂呈无色，取出粗粉，干燥至恒重。精密称定0.4 g干燥后的粗粉，置50 mL具塞锥形瓶内，加20 mL甲醇后称重，于300 W、25 kHz超声处理50 min后放至室温，称重后用甲醇补足减失的重量，摇匀后过滤，滤液低温蒸干，加5 mL超纯水溶解残渣，溶液过D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5 cm、柱长15 cm),依次用超纯水、80%乙醇各70 mL洗脱，收集80%乙醇洗脱液，减压蒸干，甲醇溶解残渣，并转移至5 mL量瓶内，用甲醇定容，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液得供试品溶液。精密称取竹节参皂苷Ⅳa、Ⅴ、Ⅳ和人参皂苷Rc、Rd、Re、Rg1等对照品适量，分别置10 mL量瓶内，加甲醇溶解并定容，得浓度分别为0.40、0.34、0.36、0.22、0.34、0.32、0.41 mg·mL-1的单成分对照品溶液。

1.2.3精密度、稳定性与重复性的试验

取S1号样品溶液，按“1.2.1”项色谱条件连续进样6次，以14号峰作为参照峰，计算得23个共有峰相对保留时间的RSD均低于0.40%,相对峰面积的RSD均低于3.00%,表明仪器的精密度良好。取S1号样品溶液，分别于制备后0、4、8、12、24、48 h时进样，以14号峰作为参照峰，计算得23个共有峰相对保留时间的RSD均低于0.30%,相对峰面积的RSD均低于2.80%,表明供试品溶液在48 h内稳定。取6份S1样品溶液，分别进样，以14号峰作为参照峰，计算得23个共有峰相对保留时间的RSD均低于0.50%,相对峰面积的RSD均低于3.00%,表明方法的重复性良好。

1.2.4指纹图谱的建立

将22批竹节参茎叶的HPLC色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”中，把S1样品的色谱图设为参考图谱，时间窗设为0～80 min,时间宽度设为0.1 min,多点校正色谱峰后采用全谱峰匹配，通过平均值法生成竹节参茎叶的HPLC叠加图谱和共有峰模式图(R),结果见图1。

图1 22批竹节参茎叶的HPLC叠加图(A)和共有峰模式图(B)

1.2.5共有峰的紫外分析及标定

22批样品共得到23个共有峰，根据紫外吸收特征，对共有峰对应的化学成分类型进行归属。皂苷类成分的最大吸收波长多在200 nm附近；而黄酮类成分有两个特征吸收峰，峰Ⅰ(300～400 nm)由黄酮B环和丙酸侧链(桂皮酰系统)引起，峰Ⅱ(200～285 nm)由A环和侧链苯甲酰系统引起[8]。由此推测，1、4～7、9～12、15号峰为黄酮类成分，13、14、16～23号峰为皂苷类成分，而1～3、8号峰因其在230～300 nm存在明显的吸收峰，但不同于黄酮类的吸收峰，可能为其他酚类成分。利用对照品对22批样品中的共有峰进行标定，确定13号峰为人参皂苷Rg1,14号峰为人参皂苷Re, 17号峰为竹节参皂苷Ⅴ,18号峰为人参皂苷Rc, 20号峰为竹节参皂苷Ⅳa, 21号峰为人参皂苷Rd, 22号峰为竹节参皂苷Ⅳ。其中，14号峰(人参皂苷Re)的峰型较对称，且在谱图中的位置较适中，故选为参照峰。23个共有峰相对保留时间的RSD为0.02%～0.54%,相对峰面积的RSD为40.50%～187.00%,表明不同生长期样品的化学组成基本一致，但成分积累存在明显差异(表2)。

表2 23个共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD

1.2.6指纹图谱的相似度分析

22批竹节参茎叶HPLC指纹图谱与共有峰模式图(R)的相似度为0.849～0.992(表3)。批间相似度为0.666～0.996,最低值为0.666(S22、S3),最高值为0.996(S14和S20);4、5、6、7、8月份的相似度分别为0.899～0.958、0.835～0.991、0.876～0.978、0.817～0.996、0.849～0.992,表明不同生长期竹节参茎叶的特征性强，且差异明显，以4月份采收的相似度最好，化学成分组成最稳定。

表3 22批样品的相似度

1.2.7指纹图谱的聚类分析(HCA)

将22批样品中23个共有峰的“峰面积/取样量”比值标准化，然后导入SPSS 22.0软件，联接方法为Ward联接，以欧式平方距离对样品的相似程度进行系统分类。由图2可知：当分类距离为10时，22批样品可聚为2大类；其中，4月的样品可单独为一类，5、6、7、8月的样品聚为一类，与相似度结果一致，提示竹节参茎叶中各化学成分的积累量与其生长期间存在相关性。

1.2.8指纹图谱的主成分分析(PCA)

将标准化处理后22批样品的“峰面积/取样量”比值依次导入SIMCA-13.0软件进行PCA分析，提取前2个主成分，其累积贡献率达80.2%,包含了竹节参茎叶HPLC指纹图谱的主要信息(图3A)。其中，构建的模型累积解释能力参数(R2Y)为0.802,预测能力参数(Q2)为0.622,均大于0.6,说明所建模型的预测程度和区分程度均较好，能反映竹节参茎叶化学组成的主要特征。根据22批样品的PCA结果，构建PC1、PC2的得分图。由图3B可知：不同生长期的竹节参茎叶各聚为一类，其中，除4月样品外，其他月份的样品均集中在得分图中部，故以集中分布位置分为2类。4月采收的样品间离散程度最低，化学成分含量的差异较小；5月次之；7月的离散程度最高，化学成分含量的差异最大，进一步说明不同生长期竹节参茎叶的化学组成存在差异，提示竹节参茎叶成分的积累量与生长期有明确相关性。

图2 22批样品的聚类树状图

1.2.9指纹图谱的偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)

PLS-DA分析后，通过变量投影重要性指标(VIP)筛选出能引起不同生长周期竹节参茎叶成分差异的主要标记性成分，结果见图4。以VIP>1.0为标准，筛选出对竹节参茎叶分类贡献较大的7个变量，影响从大到小依次为12、9、10、7、2、19、11号峰，说明以上特征峰对不同生长周期竹节参茎叶的分类具有显著影响。结合共有特征峰的UV特征分析和对照品标定结果，认为12、9、10、7、11号峰为黄酮类成分，19号峰为皂苷类成分，而2号峰为其他酚酸类成分。

图3主成分的方差贡献率(A)和得分图(B)

图4差异标志物的VIP(n=23)

1.2.10指纹图谱的热图分析

计算22批样品中各共有峰的“峰面积/取样量”比值，黄酮类特征峰的峰面积之和占总共有峰峰面积的68.6%,而皂苷类特征峰的峰面积之和占总共有峰峰面积的10.3%。绘制竹节参茎叶不同生长期中黄酮类、皂苷类色谱峰的热图。由图5、图6可知：竹节参茎叶中的黄酮类成分以4～5月份为最高值，此生长阶段内的竹节参叶展开完全；而皂苷类成分的累积量在总体上逐渐增加，至6、7月份时达峰值，此后随着竹节参进入倒苗期，皂苷类成分的累积量略呈下降趋势。上述竹节参茎叶中皂苷类、黄酮类成分的累积变化，可能与各类成分在茎、叶中的分布差异以及茎、叶采收比例有关。提示不同生长期的竹节参茎叶可获得的主要活性物质有所不同，可在对应生长期获得相应的竹节参茎叶成分。

图5竹节参茎叶的3D光谱图

图6不同生长期皂苷类成分(A)和黄酮类成分(B、C)共有峰峰面积的的热图

2、讨论

曾考察了水-乙腈、磷酸水(0.1%)-乙腈、乙酸水(0.05%)-乙腈、水-甲醇等多种流动相系统，结果流动相为乙腈-0.1%磷酸水时，分离效果较好，基线平稳；还考察了吸收波长(190～400 nm)、柱温(25、30、35℃)、色谱柱(Ulimate XB-C18、YMC Triart-C18、Ulimate LP-C18、Ulimate AQ-18、Zorbax SB-Phenyl)、流速(0.8、1.0、1.2 mL·min-1)等因素，最终建立了文中色谱条件。文中采用HPLC法建立了不同采收期竹节参茎叶的特征指纹图谱，标记了23个共有峰，通过对照品指认出其中7个成分，能够整体表达竹节参茎叶不同生长阶段的有效成分积累特征，反映竹节参茎叶的采收时间对其内在品质的影响。22批样品的相似度为0.849～0.992,相似度较高，表明不同生长期竹节参茎叶样品的化学组分较稳定。不同生长期竹节参茎叶各化学成分的累积动态存在差异，其中，黄酮类在4～5月累积量达峰值，而皂苷类则在6～7月累积量达峰值。聚类分析和主成分分析的分析结果相似，均能对不同生长期的竹节参茎叶进行聚类，通过偏最小二乘法-判别分析确认了黄酮类(12、9、10、7、11号峰)和皂苷类(19号峰)成分是导致不同生长期竹节参茎叶质量差异的主要标志。考虑到其化学组成可能还受产地、品种、栽培技术、加工等因素的影响，不同于其近似种的人参属植物茎叶人参、三七和珠子参等“特有”属性，竹节参茎叶上述特征峰对应的化学成分，作为其质量标志物的适用性尚待研究。文中建立了竹节参茎叶的HPLC特征指纹图谱，能全面监控整个生长期的化学成分累积动态，并结合模式识别方法进行分析，为竹节参茎叶的综合利用提供了依据。

参考文献:

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文章来源:王瑶,郭佳龙,叶陈辉,等.HPLC指纹图谱分析竹节参茎叶化学成分的累积特征[J].华西药学杂志,2024,39(03):303-308.