咳嗽变异性哮喘(cough variant asthma, CVA)是一种呼吸系统疾病，与哮喘密切相关，多发于儿童，发病率呈上升趋势。[1]。西医主张用抗炎药物，但CVA病程较长，西医治疗往往忽略患者整体，其预后及长期治疗效果尚难确定[2]。中医认为CVA属咳嗽范畴，本病在肺，与肝、脾、肾相关，主要因风、痰、火、瘀、虚引起，应以化痰止咳、润肺健脾、扶正固本为主。麻杏石甘汤出自《伤寒论》[3],由麻黄、杏仁、石膏、炙甘草4味中药组成，具有多种药理活性，如抗病毒、解热抗炎、解痉平喘等[4]。据报道，麻杏石甘汤可以缓解重症肺炎大鼠肺部炎症[5];并可改善哮喘小鼠肺组织的炎症状态[6]。Notch通路存在于机体多种组织中，抑制Notch通路可改善哮喘小鼠气道炎症[7]。本研究旨在探究麻杏石甘汤对CVA及Notch通路的影响，以期为CVA的治疗提供理论支持。

一、材料与方法

1 材料

动物SPF级雄性成年SD大鼠，鼠龄7～8周，体质量200～220 g, 湖北贝恩特生物科技有限公司提供。动物生产许可证号：SCXK(鄂)2021-0027。本实验经武汉华联科动物伦理委员会批准(伦理批号：HLK-2022174903)。

药品与试剂麻黄，批号：20220115,产地：河南，杏仁，批号：20220306,产地：河北，石膏，批号：20220129,产地：山西，炙甘草，批号：20220614,产地：宁夏回族自治区，均购自武汉市第三医院中药房，由武汉市第三医院陈灵副主任药师鉴定为正品。苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色试剂盒、过碘酸希夫染色(periodic acid-Schiff, PAS)染色试剂盒、瑞氏-吉姆萨复合染色液(Wright-Giemsa)、白细胞介素(interleukin, IL)-4酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒，均为北京索莱宝生物科技有限公司生产；IL-5、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)ELISA试剂盒，均由上海碧云天生物科技有限公司生产；Notch1、Jagged1抗体，均由英国Abcam生产。

仪器PFT小动物肺功能测定仪，美国Buxco公司产品；iMark680多功能酶标仪，美国Bio-Rad公司产品；BX61光学显微镜，日本Olympus公司产品。

2 实验方法

2.1 药物配制

麻杏石甘汤由麻黄12 g、杏仁9 g、石膏18 g、炙甘草6 g 4味药组成，共计45 g。麻黄、甘草加入蒸馏水1 000 mL浸泡0.5 h, 再煎煮1 h; 将杏仁、石膏用纱布包裹与麻黄、炙甘草同煮0.5 h; 过滤，药渣加入蒸馏水1 000 mL继续煎煮0.5 h; 过滤，合并滤液，继续浓缩至4 g·mL-1;5 ℃储存，备用。

2.2 模型构建

大鼠肌内注射卵清蛋白溶液(4%,每只0.5 mL)联合腹腔注射2%氢氧化铝溶液(每只0.2 mL)致敏，每周1次，连续2周[8];雾化吸入辣椒素溶液后，以大鼠咳嗽次数是否显著增加，判断造模是否成功。

2.3 动物分组与处置方法

将造模成功的大鼠随机分为模型组、联合组和低、中、高剂量实验组，取未进行致敏处理的大鼠为对照组，每组10只。各组大鼠每2 d雾化吸入1%卵清蛋白溶液激发，连续28 d, 其中，低、中、高剂量实验组根据文献[9]中关于人与动物等效剂量换算，每次激发前1 h, 分别灌胃给予4、8和16 g·kg-1麻杏石甘汤，相当于临床剂量的1倍、2倍、4倍。联合组每次激发前1 h, 灌胃给予16 g·kg-1麻杏石甘汤和腹腔注射200 mg·kg-1Jagged1[10]。对照组和模型组灌胃与腹腔注射等量的0.9%NaCl。

2.4 辣椒素引咳法检测咳嗽次数[8]

将大鼠放于密闭玻璃罩中，以雾化吸入辣椒素溶液(1×104mol·L-1)的方式引咳1 min, 停止雾化，1 min后打开玻璃罩，用专业录音设备记录5 min内大鼠咳嗽次数。

2.5 肺功能仪检测气道高反应[11]

于末次激发后，各组大鼠进行麻醉，切开大鼠气管进行插管，将气管留置导管连接大鼠肺功能仪，以通气平衡后阻力作为基值，按照0、3.125、6.250、12.500、25.000 mg·mL-1依次雾化吸入乙酰胆碱，每次3 min, 间隔2 min, 记录气道阻力值。

2.6 瑞氏-吉姆萨染色法检测肺泡灌洗液各炎症细胞比例[11]

肺功能检测完成后，处死大鼠，75%乙醇浸泡2 min后，行气管插管，迅速结扎左侧主支气管，经气管导管向右肺灌注0.9%NaCl 10 mL,共灌注3次，收集灌洗液，离心弃上清液；沉淀细胞加入0.9%NaCl 800 μL混匀，制备细胞悬液，进行涂片，用瑞氏-吉姆萨染液染色后，对炎性细胞进行分类并计数。

2.7 HE和PAS染色法观察肺组织病理学变化及杯状细胞计数[8]

取出右肺上叶组织，在10%中性福尔马林溶液中固定，分别用70%、80%、90%、100%乙醇进行梯度脱水，脱水后浸入二甲苯中透明处理30 min, 经过石蜡包埋、切片、烤片、脱蜡、脱水，制备石蜡切片。取石蜡切片，经过HE和PAS染色分别观察大鼠肺组织病理组织变化和杯状细胞数目。

2.8 ELISA法检测IL-4、IL-5和TNF-α的水平[8]

取剩余右肺组织，一部分冻存备用，另一部分在冰上研磨，以4 000 r·min-1离心20 min, 取上清液，按照ELISA试剂盒说明检测肺组织中IL-4、IL-5和TNF-α水平。

2.9 蛋白质印迹法检测肺组织中Notch1和Jagged1蛋白的表达水平

取“2.8”中冻存肺组织，用蛋白裂解液提取蛋白，用BCA法对蛋白含量进行定量分析。按文献[8]的方法进行操作，显影曝光处理，以β-actin为内参，用Image J软件分析Notch1和Jagged1蛋白相对表达水平。

3 统计学处理

用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料(符合正态分布)用

表示，方差齐者用F检验进行单因素方差分析，方差不齐者用秩和检验，2组间比较用LSD检验。

二、结果

1 各组大鼠一般行为观察与咳嗽次数的比较

对照组给予等量0.9%NaCl, 模型组给予1%卵清蛋白，低剂量实验组给予4 g·kg-1麻杏石甘汤，中剂量实验组给予8 g·kg-1麻杏石甘汤，高剂量实验组给予16 g·kg-1麻杏石甘汤，联合组给予16 g·kg-1麻杏石甘汤+200 mg·kg-1Jagged1。

对照组、模型组、低剂量实验组、中剂量实验组、高剂量实验组和联合组的咳嗽次数分别为(2.04±0.08)、(9.21±0.82)、(7.38±0.60)、(5.44±0.42)、(3.14±0.32)和(7.88±0.65)次。对照组大鼠行为正常，气息平稳，毛发有光泽，无明显咳嗽现象；模型组相比于对照组，大鼠呼吸急促，出现流涕现象，毛发枯槁无光，咳嗽次数明显增多(P<0.05);低、中、高剂量实验组与模型组比较，大鼠呼吸相对平稳，咳嗽次数依次减少(均P<0.05);联合组相比于高剂量实验组，大鼠咳嗽次数明显增多(P<0.05)。

2 各组大鼠气道高反应的比较

如表1所示，各组大鼠的气道阻力基值比较，在统计学上差异均无统计学意义(均P>0.05)。吸入乙酰胆碱后，各组大鼠气道阻力逐渐增加；模型组与对照组相比，大鼠吸入乙酰胆碱后，大鼠气道阻力显著升高，乙酰胆碱浓度越高，阻力值越高(均P<0.05);低、中、高剂量实验组与模型组相比，大鼠气道阻力逐渐降低(均P<0.05);联合组与高剂量实验组比较，大鼠气道阻力均显著升高(P<0.05)。

3 各组大鼠组织病理学比较

HE结果显示：对照组大鼠肺组织中细胞排列整齐、支气管结构正常，肺泡内无充血、水肿现象，未见炎症细胞浸润；模型组大鼠出现肺泡塌陷、间质变宽，支气管黏膜上皮细胞脱落，管腔黏液增多，出现水肿及纤维化，有大量炎症细胞浸润；低、中、高剂量实验组大鼠肺泡形态逐渐恢复正常，支气管黏膜上皮细胞脱落、管腔黏液、炎症细胞依次减少，水肿及纤维化减轻；联合组大鼠相对于高剂量实验组肺组织损伤严重。结果见图1。

表1各组大鼠气道阻力的比较

如图2所示，经PAS染色后，大鼠气道黏膜杯状细胞呈现紫红色。对照组、模型组、低剂量实验组、中剂量实验组、高剂量实验组和联合组大鼠肺组织的杯状细胞个数分别为(13.65±1.24)、(59.66±5.54)、(47.21±4.12)、(34.58±3.01)、(23.54±2.06)和(39.25±3.68)个。模型组相较于对照组，杯状细胞个数显著增多(P<0.05);低、中、高剂量实验组的杯状细胞个数依次减少(均P<0.05);联合组与高剂量实验组相比，杯状细胞个数显著增多(P<0.05)。

4 各组大鼠肺泡灌洗液炎性细胞比例的比较

如表2所示：模型组与对照组相比，大鼠肺泡灌洗液炎性细胞总数、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞数目均显著增加(均P<0.05);低、中、高剂量实验组与模型组相比，大鼠泡灌洗液炎性细胞总数、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞数目均显著减少(均P<0.05);联合组与高剂量实验组相比，大鼠肺泡灌洗液炎性细胞总数、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞数目均显著升高(均P<0.05)。

5 各组大鼠肺组织中IL-4、IL-5和TNF-α水平的比较

如表3所示，模型组与对照组相比，大鼠肺组织中IL-4、IL-5和TNF-α水平均显著升高(均P<0.05);低、中、高剂量实验组与模型组相比，大鼠肺组织中IL-4、IL-5和TNF-α水平均依次降低(均P<0.05);联合组与高剂量实验组相比，大鼠肺组织中IL-4、IL-5和TNF-α水平均显著升高(均P<0.05)。

图1用苏木精-伊红染色观察大鼠肺组织病理学变化(×100)

图2各组大鼠肺组织过碘酸希夫染色(PAS)染色(×200)

6 各组大鼠肺组织中Notch1、Jagged1蛋白表达的比较

如图3所示：对照组、模型组、低剂量实验组、中剂量实验组、高剂量实验组和联合组大鼠肺组织中Notch1蛋白相对表达水平分别为0.42±0.03、1.16±0.09、0.97±0.09、0.76±0.07、0.59±0.05和0.89±0.07,Jagged1蛋白相对表达水平分别为0.36±0.03、1.09±0.04、0.92±0.09、0.70±0.07、0.46±0.04和0.79±0.07。模型组与对照组相比，大鼠肺组织中Notch1、Jagged1蛋白相对表达水平均显著升高(均P<0.05);低、中、高剂量实验组与模型组相比，大鼠肺组织中Notch1、Jagged1蛋白相对表达水平依次降低(均P<0.05);联合组与高剂量实验组相比，大鼠肺组织中Notch1、Jagged1蛋白相对表达水平均显著升高(均P<0.05)。

表2各组大鼠肺泡灌洗液各炎性细胞比例的比较

表3各组大鼠肺组织中白细胞介素(IL)-4、IL-5和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平的比较

图3各组大鼠肺组织中Notch1、Jagged1蛋白表达的比较

三、讨论

CVA临床表现主要为咳嗽，由于没有明显的呼吸困难、喘息、胸闷等症状，易被误诊而错过最佳治疗时期，进而进一步发展为典型的哮喘。CVA的主要发病机制为免疫细胞分化的失衡，表现症状为气道炎症，气道壁结构改变，气道阻力增加，大量促炎因子，如IL-4、IL-5、TNF-α等在气道过表达，嗜酸性粒细胞等炎性细胞在肺部积累[12],炎症细胞浸润，免疫调节失衡。缓解炎症反应是治疗CVA的主要手段之一。本研究通过卵清蛋白致敏建立CVA模型大鼠，结果发现，造模大鼠咳嗽次数增多，气道阻力增高，肺部发生明显病变，炎症细胞数量减少，促炎因子水平下降，与既往研究结果一致[13-14],符合CVA临床特征，提示CVA模型复制成功。麻杏石甘汤以麻黄为主(发汗宣肺),石膏为辅(清泻肺热),杏仁为佐(宣利肺气),甘草为使(调和诸药)。药理成分复杂，主要活性成分为麻黄碱及黄酮类化合物(麻黄)、D-苦杏仁苷(杏仁)、含水硫酸钙(石膏)、甘草酸(炙甘草),具有宣肺平喘、镇咳清痰、清热解毒、抗菌消炎的作用[4]。已有研究证明，麻杏石甘汤可以降低哮喘小鼠吸入乙酰胆碱后气道阻力值，降低炎症因子水平，缓解哮喘以及CVA疾病引起的气道炎症[15-18]。本研究结果表明，麻杏石甘汤可以改善大鼠肺部病理损伤减少杯状细胞增生，肺泡灌洗液中炎性细胞的数量明显减少，肺组织中炎症因子水平明显降低；吸入乙酰胆碱后，气道阻力下降，提示麻杏石甘汤可以改善CVA导致的肺部损伤。

Notch信号通路是由表面受体(Notch1、Notch2、Notch3、Notch4)、配体(Jagged1、Jagged2、Delta1、Delta3、Delta4)以及DNA结合蛋白构成，参与多种系统相关细胞的增殖、分化与凋亡，在肺部组织细胞的发育、损伤及修复过程具有关键的调控作用[19]。CVA引起的气道炎症导致酸性粒细胞在肺部大量募集，有研究表明，Notch信号通路参与炎性细胞(如嗜酸性粒细胞)的增殖、分化[20]。HUA等[21]研究表明，大黄素可以通过调节Notch信号通路减轻小鼠CVA的气道炎症。王坤等[22]研究发现，抑制Notch1/Jagged1通路，可促进大鼠骨髓间充质干细胞“归巢”,进而改善哮喘。本研究结果显示：CVA大鼠肺组织中Notch1、Jagged1蛋白表达上调，表明Notch1/Jagged1通路可能参与介导CVA致肺损伤进展；麻杏石甘汤可以明显降低肺CVA大鼠肺组织中Notch1、Jagged1蛋白表达以及肺泡灌洗液中各种炎性细胞的数量，肺组织中IL-4、IL-5、TNF-α水平随之降低；Notch信号通路激活剂Jagged1可以逆转麻杏石甘汤对大鼠肺组织损伤的保护作用，提示麻杏石甘汤可能通过抑制Notch1/Jagged1通路，减轻CVA大鼠肺组织损伤。

本研究提示，麻杏石甘汤可以缓解CVA大鼠肺组织损伤，其作用机制可能与抑制Notch1/Jagged1信号通路激活有关。

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基金资助:武汉市中医药科研基金资助项目(WZ22Q11);

文章来源:杨倩,孙勤国,江波,等.麻杏石甘汤对咳嗽变异性哮喘大鼠肺组织损伤的影响[J].中国临床药理学杂志,2024,40(21):3130-3135.