大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatumL.、唐古特大黄R.tanguticumMaxim.ex Balf.或药用大黄R.officinaleBaill.的干燥根和根茎，具有抗炎、抗氧化的作用[1-2]。目前关于大黄抗炎活性的研究主要集中于单一成分的研究，如大黄素可通过降低炎症因子的释放发挥抗炎作用、大黄酚通过抑制引起炎症反应的细胞因子及白介素分泌表现出抗炎活性，不能全面反映大黄抗炎活性的物质基础[3-4]。课题组前期通过建立唐古特大黄抗炎谱效关系，确定了唐古特大黄的抗炎活性成分组(RTAC),包含番泻苷A、番泻苷B、芒柄花苷、芒柄花素、大黄素、大黄素甲醚、芦荟大黄素、大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄酚、大黄酸等10种化合物，并发现其具有良好的体外抗炎作用，优于单一成分。目前关于RTAC的提取、分离、纯化和体内抗炎作用尚无研究报道，故寻找简便高效的RTAC样品制备方法和进行体内抗炎作用研究具有重要意义。现对RTAC的分离纯化工艺进行优化，并研究其在小鼠体内的抗炎活性，以期为唐古特大黄的质量控制和临床应用提供参考。

1、实验部分

1仪器、试药与动物

1260型高效液相色谱仪(美国Agilent);Spectra Max190型酶标仪(上海美谷分子仪器有限公司)。番泻苷A、番泻苷B、芒柄花苷、芒柄花素、大黄素、大黄素甲醚、芦荟大黄素、大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄酚、大黄酸等对照品(成都埃法生物科技有限公司，纯度≥98.0%);AB-8、D101、HPD-400、HPD-500、HPD-826、HPD-100、HP-20、X-5型大孔吸附树脂(北京索莱宝科技有限公司);XDA-1型大孔吸附树脂(上海源叶生物科技有限公司);唐古特大黄统片(甘肃省甘南百草生物科技开发有限公司，经甘南科技开发交流中心甘玉伟研究员鉴定为正品);甲醇、甲酸为色谱纯；水为纯净水；其余试剂为分析纯。SPF级♂昆明种小鼠(北京华阜康生物科技股份有限公司，动物许可证号：SCXK京2019-0008),饲养于甘肃中医药大学SPF级实验动物中心，体重20±2 g。

1.2方法与结果

1.2.1溶液的制备

精密称取各对照品适量，取10 mL甲醇定容，制成番泻苷B、芒柄花苷、番泻苷A、大黄素-8-O-葡萄糖苷、芒柄花素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚浓度分别为0.18、0.05、0.74、0.47、0.17、0.11、0.10、0.05、0.07、0.10 mg·mL-1的混合对照品溶液。取唐古特大黄药材统片，粉碎，过3号筛，精密称取1 g粉末，加25 mL甲醇，于35±5℃、20 kHz超声提取1 h,过滤，取续滤液作为供试品溶液。

1.2.2色谱条件

采用Agilent TC-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5μm),流动相为0.1%甲酸溶液(A)-甲醇(B),梯度洗脱(0～6 min、10%～30%B,6～13 min、30%～33%B,13～21 min、33%～37%B,21～25 min、37%～40%B,25～35 min、40%～45%B,35～45 min、45%～48%B,45～49 min、48%～60%B,49～54 min、60%～67%B,54～64 min、67%～95%B,64～74 min、95%～10%B,74～78 min、10%B),流速1 mL·min-1,柱温30℃,进样量10μL,检测波长280 nm。在上述色谱条件下，混合对照品和供试品溶液的HPLC色谱图见图1。

图1混合对照品(A)和供试品(B)溶液的HPLC图

1.2.3线性关系的考察

取“1.2.1”项制备的混合对照品溶液，用2倍稀释法依次稀释，得5个浓度的线性对照品溶液，按“1.2.2”项色谱条件，分别进样测定。以峰面积为纵坐标、对照品浓度(μg·mL-1)为横坐标，得各指标成分的回归方程及线性范围(表1)。

表1各成分线性关系

1.2.4精密度、稳定性、重复性与加样回收的试验

取“1.2.1”项制备的混合对照品溶液，按“1.2.2”项色谱条件，连续进样6次，计算各指标成分相对峰面积的RSD,表明仪器的精密度良好(表2)。取同一份供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、24 h时进样测定，计算各指标成分相对峰面积的RSD,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好(表2)。取6份唐古特大黄样品，制备供试品溶液，分别进样测定，计算各指标成分含量的RSD,表明重复性良好(表2)。精密称取已知各指标成分含量的唐古特大黄样品粉末0.5 g,共6份，按“1.2.1”项方法制备供试品溶液，以1:1的比例加入各指标成分的对照品，分别进样测定，计算各指标成分的加样回收率及RSD(表2)。

表2方法学的考察结果(%,n=6)

1.2.5唐古特大黄抗炎活性成分组(RTAC)的提取分离

按“1.2.1”项下方法制备唐古特大黄甲醇提取液，浓缩得浸膏，用蒸馏水复溶后，依次用石油醚、二氯甲烷、水饱和正丁醇萃取，各部位萃取液挥干溶剂，得浸膏。精密称取各萃取部位浸膏适量，按“1.2.2”项色谱条件，测定RTAC中10种成分在各萃取部位中的含量。由表3可知：10种成分主要存在于二氯甲烷和水饱和正丁醇部位中，故弃去石油醚部位和水部位；但水饱和正丁醇部位中仍含有许多杂质，因此，进一步考察用大孔吸附树脂纯化水饱和正丁醇部位活性成分的工艺。

1.2.6纯化工艺条件的筛选

参考文献方法进行大孔吸附树脂HPD-826、HPD-500、HPD-400、HPD-100、AB-8、D-101、HP-20、X-5、XDA-1的预处理[5]。将预处理好的9种大孔吸附树脂抽滤并称取5 g,分别置150 mL三角瓶中，加入5 mg·mL-1的水饱和正丁醇部位样品液(用20%甲醇溶解)25 mL,置恒温摇床上，于室温下以100 r·min-1振荡12 h,过滤，进行静态吸附试验。将吸附饱和的大孔吸附树脂滤干，倒入150 mL三角瓶中，各加入90%乙醇25 mL,同等条件进行静态解吸附试验。分别取吸附前、后及解吸附后的滤液适量，按“1.2.2”项色谱条件测定其中5种目标成分(番泻苷B、芒柄花苷、番泻苷A、大黄素-8-O-葡萄糖苷、芒柄花素)的峰面积。参考文献[6],计算静态吸附率[(峰面积吸附前-峰面积吸附后)/峰面积吸附前×100%]和静态解吸附率[解吸附液中各成分的峰面积/(峰面积吸附前-峰面积吸附后)×100%]。9种大孔吸附树脂对5种目标成分的静态吸附率均为100%,XDA-1型树脂对5种成分的解吸附率均高于其他大孔吸附树脂，故选择XDA-1型树脂用于后续实验(表4)。

“-”表示未检出

表3 RTAC中10种成分在各萃取部位中的含量(mg·g-1)

表4不同大孔吸附树脂对5种目标成分的解吸附率(%)

取预处理后的XDA-1型树脂适量，共3份，湿法装柱(30cm×1.6cm,柱床体积约19mL,下同),制备相同体积的浓度为4、5、6mg·mL-1的水饱和正丁醇部位样品液，分别以2BV·h-1的流速进行动态吸附，吸附毕，饱和1h后，用3BV的蒸馏水以1mL·min-1进行洗脱，合并流出液，分别按“1.2.2”项色谱条件，测定流出液中5种目标成分的峰面积，计算吸附率。XDA-1大孔吸附树脂对低、中、高浓度样品溶液中5种目标成分的平均吸附率分别为97.20%、99.16%、97.51%,均大于85%,平均吸附率随上样药液浓度的增大先升高后下降，5mg·mL-1时的平均吸附率较高，故选择上样浓度5mg·mL-1。取预处理后的XDA-1型树脂适量，湿法装柱，以5mg·mL-1的水饱和正丁醇部位样品液300mL上样，每1BV收集1份流出液，按“1.2.2”项色谱条件，测定各成分的峰面积，绘制泄露曲线。因峰面积与成分的浓度成正比，故当流出液中该成分峰面积为上样药液的1/10时，认为该成分达到泄露点，且以泄漏点时的体积作为最大上样体积。由图2可知：上样量为13BV时，番泻苷B、芒柄花苷、番泻苷A、大黄素-8-O-葡萄糖苷均已达到泄露，芒柄花素虽未达到泄露，但趋于稳定，继续上样会造成其余4种成分的浪费，故选择13 BV为最大上样体积。

图2 5种目标成分在XDA-1型树脂上的泄露曲线

取预处理后的XDA-1型树脂适量，湿法装柱，用13 BV的5 mg·mL-1水饱和正丁醇部位样品液上样，以1 mL·min-1水洗除杂，每1 BV收集1份流出液，按“1.2.2”项色谱条件，测定5种目标成分的峰面积。水洗用量达到17 BV时，流出液经HPLC检测并未带走所需成分，且流出液已变澄清，不能再除去杂质，因此，选择17 BV的水进行洗脱除杂。将预处理后的XDA-1型大孔吸附树脂抽滤并称取5 g,共5份，分别置150 mL三角瓶中，加入5 mg·mL-1的水饱和正丁醇部位样品液25 mL,按上述方法进行静态吸附试验。将吸附饱和的大孔吸附树脂滤干，倒入150 mL三角瓶中，分别加入20%、30%、50%、70%、90%的乙醇各25 mL,同等条件进行静态解吸附试验，计算不同浓度乙醇解吸附后，RTAC中5种目标成分的静态解吸附率，20%乙醇对5种目标成分的解吸附率为0。由表5可知：乙醇浓度30%～90%时，浓度越大，5种目标成分的解吸附率越大，90%乙醇的解吸附率最大，故确定洗脱剂为90%乙醇。取预处理后的XDA-1型树脂适量，湿法装柱，以13 BV的5 mg·mL-1水饱和正丁醇部位样品液上样，先用17 BV的蒸馏水洗脱除杂，再用90%乙醇洗脱，测定流出液。90%乙醇用量为6 BV时，5种目标成分已完全流出，7 BV流出液中已不含所需成分，故选择6 BV 90%乙醇进行洗脱。

表5不同浓度乙醇对5种目标成分的解吸附率(%)

1.2.7验证实验

取预处理后的XDA-1型树脂适量，湿法装柱，用13BV的5mg·mL-1水饱和正丁醇部位样品液，按流速2BV·h-1上样，吸附毕，饱和1h后，以17BV、流速1mL·min-1水洗除杂后，用6BV的90%乙醇洗脱，收集洗脱液，水浴挥干乙醇，按“1.2.2”项色谱条件，测定5种目标成分的含量，重复操作3次。结果表明：5种目标成分的含量从6.41%升至42.01%。将纯化后的水饱和正丁醇部位与二氯甲烷部位混合后，再进行HPLC测定，重复操作3次，结果RTAC中10种主要成分的含量从6.27%升至40.08%。

1.2.8抗炎作用的考察[7-8]

动物实验经甘肃中医药大学实验动物伦理委员会批准，审批号：2021-215。取昆明小鼠70只，随机均分为空白组、模型组、唐古特大黄甲醇提取物组(812.40mg·kg-1)、RTAC对照品组(68.89mg·kg-1)和RTAC低、中、高剂量组(134.80、269.50、539.00mg·kg-1)。空白组、模型组ig蒸馏水25mL·kg-1,其余各组ig给予相应剂量的药物，连续7d,每日1次。末次给药1h后，在小鼠右耳两面均匀涂布50μL二甲苯致炎，在30min后脱颈椎处死，将从耳根剪下的双耳叠放整齐后，用8mm打孔器打下耳片，精确称重，计算耳廓肿胀度(右耳重量-左耳重量)及肿胀抑制率。肿胀抑制率=(平均肿胀率模型组-平均肿胀率给药组)/平均肿胀度模型组×100%。取小鼠70只，按上述方法分组与给药，于末次给药后30min,小鼠右后肢足跖皮下注射20μL10%甲醛，4h后脱颈椎处死小鼠，于踝关节处剪下左右后足，精确称重，计算足趾肿胀度(右足重量-左足重量)及肿胀抑制率。取小鼠70只，按上述方法分组与给药，ip5%水合氯醛8μL·g-1麻醉小鼠，背部切口，将两个精密称定重量的灭菌棉球，分别植入小鼠两侧腋窝皮下。术后次日ig给药，末次给药后1h,处死小鼠，剥离出肉芽肿棉球，剔除脂肪组织，于60℃烘干6h,精密称重，计算棉球肉芽肿胀度(棉球重量烘干后-棉球重量原有)和肿胀抑制率。由表6可知：与模型组比较，各给药组小鼠耳廓、足跖及棉球肉芽的肿胀度均显著降低(P<0.01),RTAC对小鼠耳肿胀和足肿胀的抑制程度随剂量的增加而增加。与甲醇提取物组比较，RTAC高剂量显著降低小鼠的耳廓和足跖肿胀度(P<0.01);RTAC中、高剂量显著降低小鼠的棉球肉芽肿胀度(P<0.01)。

与空白组比较：*P<0.01;与模型组比较：△P<0.01

表6 RTAC对小鼠耳、足和棉球肉芽肿胀度的影响

2、讨论

文中建立了唐古特大黄抗炎活性成分组(RTAC)中10种主要成分的含量测定方法，并以这些成分的含量为指标考察其纯化工艺。将进一步纯化后的水饱和正丁醇部位与二氯甲烷部位混合，保证了RTAC中10种成分的完整性；经优选工艺提取、分离和纯化后，主要成分的含量从6.27%升至40.08%,表明优选的RTAC提取、分离及纯化工艺可行。唐古特大黄抗炎药效的强弱与其活性成分的含量和用量密切相关，是临床用药的重要参数。大孔吸附树脂广泛应用于中药有效成分和活性成分组的分离纯化，洗脱剂多为乙醇，所得成分组极性较大；系统溶剂法主要使用有机溶剂，所得成分组极性较小；故混合两者所提取成分时，应选择有效的混合试剂使其充分混合，且混合后各成分的性质不变，对口服吸收无影响。文中还建立了二甲苯致小鼠耳廓肿胀、甲醛致小鼠足肿胀和小鼠棉球肉芽肿炎症模型，考察纯化后RTAC的抗炎活性。结果纯化后RTAC各剂量均可显著减低肿胀度(P<0.01),且高剂量的效果显著优于纯化前的唐古特大黄甲醇提取物组(P<0.01),表明纯化后RTAC对小鼠炎症反应具有一定的干预治疗效果，且优于甲醇提取物组，表明提高药效组分的含量可增强药效。

参考文献:

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基金资助:国家自然基金联合基金重点项目(U21A20412);甘肃省教育厅“双一流”科研重点项目(GSSYLXM-05);

文章来源:叶蕾蕾,张成园,翟婷,等.唐古特大黄抗炎成分的纯化工艺优化及其抗炎作用研究[J].华西药学杂志,2024,39(05):503-508.