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BUB1B与胰腺癌的发生、免疫浸润细胞及预后的相关性分析

2024-04-24 25 上传者：管理员

摘要：目的:利用在线数据库和生物信息学的方法，研究BUB1B在胰腺腺癌(pancreatic adenocarcinoma, PAAD)组织中的表达水平及与预后和免疫细胞浸润的相关性。方法:利用GEPIA数据库分析BUB1B在各种癌症中的表达情况；GEPIA、Kaplan-Meier Plotter数据库检索BUB1B的表达与PAAD患者预后的相关性；随后利用String数据库构建BUB1B共表达基因的蛋白互作网络，并用David数据库分析其GO生物学功能及KEGG信号通路；最后使用TIMER数据库分析BUB1B基因的表达与免疫浸润细胞之间的相关性。结果:在PADD组织中，BUB1B表达水平高于正常组织(P<0.01);BUB1B的高转录水平与性别、年龄、种族、肥胖状况、饮酒习惯、慢性胰腺炎、淋巴转移和癌症阶段密切相关(P<0.05);BUB1B mRNA表达水平与PAAD预后和免疫细胞浸润相关(P<0.05)。结论:BUB1B在PADD中高表达，与PAAD预后、免疫浸润相关，可作为胰腺癌诊断、预后、药物治疗的潜在标志物。

关键词：
BUB1B
PAAD
基因
手术治疗
胰腺癌
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胰腺腺癌(pancreatic adenocarcinoma, PAAD)是一种高度恶性的腹部肿瘤，位居全球第七大癌症相关死亡原因[1]。手术是治疗PAAD最有效的方法，然而PAAD的发病隐匿，80%以上的患者确诊时已达到中晚期，并出现转移迹象，导致这些患者无法切除肿瘤或不适合手术[2]。虽然为改善患者预后做出了大量努力，但PAAD患者的5年总生存率通常<9%[3]。因此，探索PAAD形成的分子机制，提高治疗效果，改善PAAD患者的预后，延长患者的生存期刻不容缓。

BUB1B基因编码1种参与纺锤体检查点功能的激酶，即有丝分裂检查点丝氨酸/苏氨酸激酶B,并在抑制有丝分裂后期促进复合物(APC/C)中发挥作用[4]。BUB1B作为有丝分裂的关键调节因子，其表达异常已被证明与多种恶性肿瘤高度相关，如白血病、胃癌、乳腺癌和肝癌等[5,6,7]。另有研究显示BUB1B与肺腺癌的转移密切相关[8],且其过度表达与肺腺癌患者总生存率降低有关[9]。目前，关于BUB1B是否参与PAAD发展的研究较少。因此，本研究利用GEPIA、Kaplan-Meier Plotter、STRING、TIMER等多个数据库综合分析BUB1B在PAAD中的表达情况以及与患者预后情况的关系，探讨BUB1B在PAAD中的调控机制，并初步分析BUB1B在癌症微环境中的表达、与免疫浸润的相关关系，为阐明BUB1B基因在PAAD发生发展中奠定理论与数据支持。

1、对象与方法

1.1 GEPIA数据库中BUB1B表达分析

利用GEPIA数据库分析BUB1B在不同癌症中的表达情况，并分析比较BUB1B在癌症组织中及正常组织中的表达情况[10]。

1.2 UALCAN数据库

基于UALCAN分析网站分析BUB1B在PAAD组织中的表达以及BUB1B表达与临床病理参数的关系及意义。

1.3 Kaplan-Meier Plotter数据库

Kaplan-Meier Plotter数据库可为常见癌症的mRNA、miRNA、蛋白和DNA提供生存分析[11]。根据目的基因表达水平将癌症患者分为高表达和低表达，对其总生存期(overall survival, OS)和无复发生存期(relapse-free survival, RFS)进行分析，计算风险比(hazard ratio, HR),使用Long-Rank计算高表达和低表达两组生存曲线之间的差异。本研究使用Kaplan-Meier数据库对PAAD患者BUB1B的OS和RFS进行了分析，检索条件为：“Gene symbol: BUB1B”“Split patients by: median”“Survival: OS”“Cancer: PADD”。

1.4 TIMER数据库

TIMER数据库包含来自TCGA数据库的32种癌症以及多个组织样本信息，可用于分析一种或多种癌症与免疫细胞浸润的相关性[12]。在本研究中，输入“Gene symbol=BUB1B”,验证BUB1B在PAAD中的表达情况及预后，并分析B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞(neutrophils)、巨噬细胞(macrophages)和树突状细胞(dendritic cells)在内的免疫细胞浸润在PADD患者中的预后，以及以上所有细胞在组织中的浸润情况及其与BUB1B的相关性。通过“Gene”模块分析BUB1B与免疫浸润细胞的相关性。

1.5 蛋白质相互作用(protein-protein interaction networks, PPI)网络和模块分析

STRING数据库是分析蛋白与PPI的检索网站，可利用已证实和可预测的蛋白相互信息，构建PPI网络，它可以准确找到与目标蛋白相关作用的其他蛋白。在该数据库的“Protein Name”框中输入“BUB1B”,在“Organism”框中输入“Homo sapiens”,“interaction score>0.4”被认为有意义，从而构建与BUB1B相关蛋白的PPI网络。

1.6 BUBIB相互作用网络的功能富集分析

利用STRING构建PPI网络后，在Metascape数据库中进行GO功能注释和KEGG通路富集分析，探讨BUB1B的PPI网络在生物学过程、分子功能、细胞成分以及KEGG信号通路的富集情况。

2、结果

2.1 BUB1B在不同癌症组织和正常组织中的差异表达

BUB1B基于GEPIA数据库中收录的所有癌症组织与正常组织的表达比较见图1。其中横坐标是不同癌症和正常组织，纵坐标是BUB1B的表达。与同组正常癌旁组织相比，BUB1B在急性髓细胞样白细胞病(LAML)中呈低表达；在膀胱癌(BLCA)、乳腺癌(BRCA)、宫颈癌(CESC)、结肠癌(COAD)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBA)、食管癌(ESCA)、多形成性胶质细胞瘤(GBM)、头颈鳞状细胞癌(HNSC)、肝细胞肝癌(LIHC)、肺腺癌(LUAD)、卵巢浆液性囊腺癌(OV)、胰腺癌(PAAD)、直肠腺癌(READ)、皮肤黑色素瘤(SKCM)、胸腺癌(THYM)、子宫内膜癌(CUEC)、子宫肉瘤(UCS)等大多数癌症组织中呈高表达，表明高表达的BUB1B初步可以作为诊断PADD的潜在生物标志物。

2.2 BUB1B在PADD组织与正常组织间的差异表达

本研究初步利用GEPIA数据库分析PADD组织和正常组织中BUB1B的差异表达水平，进一步提取了TCGA和GTEx数据库中PADD患者179例，正常对照171例，显示BUB1B表达水平在PADD中显著升高。见图2。

图1 BUB1B在所有癌症组织(Tumor)和正常组织(Normal)中的表达比较

图2 BUB1B在PADD组织中和正常组织中的表达差异（P<0.01)

2.3 BUB1B表达水平与PADD患者临床病理参数的关系

利用在线数据库UALCAN检索源自TCGA数据库中PADD的临床数据，从而进一步验证了BUB1B在PADD组织中的表达水平，结果表明BUB1B在肿瘤组织中的表达水平明显高于正常组织(P<0.01)。进一步比较不同性别、年龄、种族、肥胖状况、饮酒习惯、慢性胰腺炎、淋巴转移和癌症分期下PADD组织与正常组织中BUB1B的表达，见图3。男性和女性PADD患者BUB1B mRNA水平均高于正常组织。另外发现BUB1B的高转录水平与性别、年龄、种族、肥胖状况、饮酒习惯、慢性胰腺炎、淋巴转移和癌症阶段密切相关(P<0.05)。因此提示BUB1B mRNA的异常表达与PADD进程有关，BUB1B mRNA有望成为阻断PADD发展的药物靶点。

图3 BUB1B表达水平与PADD患者临床病理参数的关系

2.4 PADD组织中BUB1B mRNA的表达与预后、免疫浸润的关系

通过Kaplan-Meier数据库对BUB1B mRNA表达与PADD患者预后的关系进行分析，结果显示，BUB1B mRNA表达水平与PADD患者的OS和RFS显著相关，Log-Rank P<0.05。在PADD中，BUB1B mRNA高表达患者的OS和RFS显著低于低表达患者，P值分别为0.000 93和0.000 061,HR分别为1.98(1.31～2.99)和4.76(2.06～10.98),提示BUB1B高表达可能是PADD患者的不良预后因子。见图4。

通过TIMER数据库对BUB1B表达与常见6种免疫细胞之间的相关性分析可以看出，BUB1B在PADD的表达水平与PADD纯度无明显的相关性。BUB1B与B细胞(r=0.220)和树突细胞(r=0.219)呈显著正相关(P<0.05);BUB1B与CD4+T细胞呈显著负相关(r=-0.208,P<0.05);而与CD8+T细胞(r=0.143)和中性粒细胞(r=0.089)浸润水平呈正相关，与巨噬细胞(r=-0.013)浸润水平呈负相关，但差异均无统计学意义(P>0.05)。见图5。

图4 BUB1B mRNA表达与PADD患者预后的关系

图5 BUB1B mRNA与常见免疫细胞相关性分析

2.5 基因的GO功能富集和KEGG通路分析

为更好地了解BUB1B的功能作用机制，使用STING用于构建BUB1B的PPI网络，共有10个预测的功能蛋白(BUB3、CDC20、CDK1、CCNB1、MAD2L1、PLK1、CDC27、CENPE、ANAPC4、CASC5)与BUB1B相互作用，且呈显著相关，它们的得分均>0.4,蛋白网络富集P<1.3e-13,见图6。为进一步确定它们之间的关系，通过在线网站GEPIA分析这些蛋白基因，结果发现在PADD中BUB1B基因与NUSAP1、ARHGAP11A、CDK1、BUB1等基因的表达成正相关(图7),进一步提示BUB1B作为一种癌基因与PADD患者预后不良相关，并且可通过正向调节这些蛋白，从而参与PADD的侵袭转移。

为研究构建的PPI网络潜在的作用，本研究使用Metascape在线分析，对这些基因进行GO功能富集和KEGG通路富集分析。如图8所示，在BP(生物过程)中主要涉及线粒体ATP合成的正调控、心室心肌细胞发育、有丝分裂中期/后期转变的调控、有丝分裂中期/后期的正向调控；CC(细胞成分)主要位于APC/C、中心体、染色体区域、转移酶、蛋白质复合物、纺锤中央区；MF(分子功能)主要包括APC/C的构建；KEGG通路主要包括细胞周期、卵母细胞成熟、卵母细胞减数分裂、人T细胞白血病毒1的感染、P53信号通路、泛素介导的蛋白水解通路。

图6 与BUB1B基因相关的蛋白质-蛋白质相互作用网络

图7 PADD中与BUB1B呈现正相关的基因

图8 基因的GO功能富集分析与KEGG通路富集分析

3、讨论

本研究通过使用GEPIA数据库比较PADD组织和正常组织中BUB1B的表达水平，发现与正常组织相比，该基因在PADD组织中的表达水平较高。进一步研究发现，在PADD中，BUB1B mRNA高表达患者的OS和RFS显著低于低表达患者，提示BUB1B高表达可能是PADD患者的不良预后因子。结果提示BUB1B可能对PADD具有诊断价值和治疗价值。

为进一步研究BUB1B在PADD进展中的作用，对不同性别、年龄、种族、肥胖情况、饮酒习惯、癌症分期、有无淋巴结转移等情况下BUB1B的表达情况进行了分析，结果表明，相比于正常组织，BUB1B在不同的癌症分期、性别、年龄、种族、肥胖状况、有饮酒习惯、有慢性胰腺炎、伴随淋巴结转移时显著升高，这表明PADD组织中BUB1B mRNA的异常表达与癌症进程有关，有望成为阻断PADD发展的药物靶点。

免疫系统守护着机体的健康，因此肿瘤细胞只有逃过免疫系统的监视和攻击才能增殖和转移，肿瘤免疫逃逸是肿瘤发生发展的重要因素[13],肿瘤免疫逃逸是肿瘤细胞发生发展的基础。免疫细胞浸润在肿瘤的进展和转移中起着重要的作用，可以从多方面影响患者的预后[14]。为进一步明确BUB1B对PADD可能存在的调节作用，本研究首先研究了BUB1B与免疫细胞浸润的相关性。BUB1B与常见免疫细胞浸润的相关性分析显示，在PADD组织中BUB1B与B细胞和树突细胞均呈显著正相关，提示BUB1B可能参与了PADD细胞的免疫调节，以增加癌症细胞的免疫逃逸，加大了癌症细胞侵袭的风险。

另外，癌症的发生机制是多分子共同作用的复杂过程，本研究把与BUB1B相互作用的10个正相关的蛋白作为关键蛋白，构建了PPI网络，并且研究了这些蛋白可能参与的相关癌症通路。结果显示，这几个蛋白在不同程度上参与了细胞周期的调节、有丝分裂中后期的调控、有丝分裂纺锤体检验点、线粒体ATP合成的正调控、心室心肌细胞发育、APC/C的构建、P53信号通路和泛素介导的蛋白水解通路等。

综上所述，BUB1B可作为PADD的潜在诊断标志和药物靶点，具体作用机制还需进一步深入研究，并探究出更有效的治疗方案，为临床治疗提供新的思路。

基金资助:中国营养学会-振东国人体质与健康研究基金(CNS-ZD2020-180);国家自然科学基金(81703269,81973097);黑龙江省自然科学基金(QC2018120);

文章来源:贾璐璐,冯小燕,田玉婷,等.BUB1B与胰腺癌的发生､免疫浸润细胞及预后的相关性分析[J].包头医学院学报,2024,40(04):1-7.