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黄芪多糖增强裸鼠胰腺癌移植瘤对吉西他滨的化疗敏感性

2024-11-08 6 上传者：管理员

摘要：目的分析黄芪多糖增强裸鼠胰腺癌移植瘤对吉西他滨的化疗敏感性的作用机制。方法选取人胰腺癌PANC-1细胞株建立裸鼠胰腺癌移植瘤模型40只，按处理方案分为4组：空白对照组、黄芪多糖组、吉西他滨组、黄芪多糖+吉西他滨组，每组10只，21 d后分离肿瘤组织称重，TUNEL染色检测凋亡，透射电镜检测自噬，QRT-PCR和Western blot检测凋亡相关基因(Bcl-2、Bax)、自噬相关基因(Beclin-1、P62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ)的mRNA和蛋白表达。比较各组瘤体积、平均瘤质量、抑瘤率、肿瘤组织坏死率、肿瘤组织中凋亡细胞数、Bcl-2、Bax、Beclin-1、P62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达。结果空白对照组、黄芪多糖组、吉西他滨组及黄芪多糖+吉西他滨组的瘤体积、平均瘤质量呈下降趋势(P<0.01);黄芪多糖组、吉西他滨组及黄芪多糖+吉西他滨组的抑瘤率、肿瘤组织坏死率呈上升趋势(P<0.01);黄芪多糖组、吉西他滨组及黄芪多糖+吉西他滨组TUNEL表达平均值均高于空白对照组，黄芪多糖+吉西他滨组TUNEL表达平均值高于黄芪多糖组、吉西他滨组(P<0.01)。与空白对照组相比，黄芪多糖组、吉西他滨组及黄芪多糖+吉西他滨组肿瘤组织Bcl-2、P62较低，Bax、Beclin-1以及LC3Ⅱ、LC3Ⅰ较高(P<0.05);与黄芪多糖组相比，吉西他滨组Bcl-2、P62较低，Bax、Beclin-1及LC3Ⅱ、LC3Ⅰ较高(P<0.05);与吉西他滨组相比，黄芪多糖+吉西他滨组Bcl-2、P62较低，Bax、Beclin-1以及LC3Ⅱ、LC3Ⅰ较高(P<0.05)。结论黄芪多糖能够有效抑制胰腺癌移植瘤生长，且与吉西他滨共同使用具有一定的增效作用，其作用为促癌细胞凋亡。

关键词：
化疗敏感
吉西他滨
胰腺癌
自噬
黄芪多糖
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胰腺癌具有恶性程度高、侵袭性强、预后差、病死率高等特征，在确诊时部分患者已经达到癌症晚期，严重者甚至出现了远处转移，错失最佳手术治疗时机。目前化疗药物是治疗胰腺癌的重要手段[1-2]。吉西他滨为进展期胰腺癌的一线化疗药物，但其疗效较差且有一定不良反应。有些中药含有多种抗肿瘤活性物质，其联合应用能显著延长胰腺癌患者的无病生存期，并改善患者的生活质量[3- 4]。研究表明，黄芪可显著改善胰腺癌患者的预后，黄芪多糖为其最重要的活性物质，具有多种功效，如抗肿瘤、抗炎、免疫调节等[5- 6]。本研究旨在分析黄芪多糖增强裸鼠胰腺癌移植瘤对吉西他滨的化疗敏感性的作用机制。

1、实验动物与方法

1.1实验动物

选取人胰腺癌PANC-1细胞株建立裸鼠胰腺癌移植瘤模型，SPF级雄性SD裸鼠40只，体质量为140～160 g,裸鼠统一饲养在20～25℃、湿度50%～60%的动物房内并进行光照12 h,随后通风换气8～12 h,所有裸鼠均饲养1周。按处理方案分为4组：空白对照组(模型组)10只和治疗组30只，治疗组又分为黄芪多糖组、吉西他滨组、黄芪多糖+吉西他滨组，每组10只。

1.2实验药物与仪器

黄芪多糖(麻城市进鑫生物科技有限公司)、注射用盐酸吉西他滨[齐鲁制药(海南)有限公司]、立式冷藏柜(广东三洋科龙冷柜有限公司)、倒置荧光显微镜(日本奥林巴斯公司IX71)、台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司5804R)、透射电镜[国仪量子技术(合肥)股份]。

1.3方法

空白对照组：生理盐水0.4 ml灌胃，每天1次，连续21 d;黄芪多糖组：黄芪多糖200μl灌胃，每天1次，连续21 d;吉西他滨组：注射用盐酸吉西他滨100 mg/kg,腹腔注射0.2 ml,每周1次，共2次；黄芪多糖+吉西他滨组：方法同黄芪多糖、吉西他滨组。实验中各组裸鼠未出现死亡情况。

1.4观察指标与方法

1.4.1各组裸鼠瘤体积、平均瘤质量、抑瘤率：

21 d后分离肿瘤组织称重，抑瘤率=(模型组平均瘤质量-治疗组平均瘤质量)/模型组平均瘤重×100%,依据webb氏分数乘积法计算：(fa)1.2=1-[1-(fa)1][1-(fa)2],(fa)1和(fa)2分别为黄芪多糖、吉西他滨组抑瘤率，(fa)1.2为2组理论相加效应，当联合用药效果和与理论相加效应相比的比值越大，说明联合用药效果越好。

1.4.2各组裸鼠肿瘤组织中凋亡细胞数：

采用TUNEL染色检测凋亡情况。消化细胞并配置成1.5×105/100μl溶液；Transwell小板准备，首先在上下室中加入培养基放入37℃中，使用动平衡1 h;下室内加入600μl含半量血清的DF12培养基；在上室内加入100μl细胞悬液；37℃培养箱中6 h, 6 h后将上室取出，PBS清洗2次；4%PFA中固定15 min, PBS清洗2次；0.5%Tritonx100反应20 min, PBS清洗2次；DAPI中反应5 min, PBS清洗2次；拍照并使用Image J软件计数统计。

1.4.3 Western印迹检测各组裸鼠Bcl-2、Bax、Beclin-1、P62、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ蛋白表达：

透射电镜检测自噬。采用BCA法测定蛋白质浓度，定量每孔50μg蛋白质，加入上样缓冲液煮沸5 min变性，并进行12.5%SDS-PAGE电泳，电泳结束后三明治夹心法湿转，条件为280 mA,2 h,脱脂牛奶室温封闭，加入一抗(1∶500稀释)4℃进行过夜孵育，并进行清洗。随后，添加二抗并在室温下孵育1 h。使用化学发光试剂进行显影，并以GAPDH作为内参，通过Image J软件来探究目标条带灰度值。

1.5统计学方法

采用SPSS 21.0软件处理数据，计量资料以表示，采用t检验，计数资料以率(%)表示，采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1各组裸鼠的瘤体积、平均瘤质量、抑瘤率比较

空白对照组、黄芪多糖组、吉西他滨组及黄芪多糖+吉西他滨组的瘤体积、平均瘤质量呈下降趋势(P<0.01);黄芪多糖组、吉西他滨组及黄芪多糖+吉西他滨组的抑瘤率、肿瘤组织坏死率呈上升趋势(P<0.01);黄芪多糖组、吉西他滨组及黄芪多糖+吉西他滨组TUNEL表达平均值均高于空白对照组，黄芪多糖+吉西他滨组TUNEL表达平均值高于黄芪多糖组、吉西他滨组(P<0.01),见表1。

2.2各组裸鼠Bcl-2、Bax、Beclin-1、P62、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ蛋白表达比较

与空白对照组相比，黄芪多糖组、吉西他滨组及黄芪多糖+吉西他滨组肿瘤组织Bcl-2、P62较低，Bax、Beclin-1以及LC3Ⅱ、LC3Ⅰ较高(P<0.05);与黄芪多糖组相比，吉西他滨组Bcl-2、P62较低，Bax、Beclin-1及LC3Ⅱ、LC3Ⅰ较高(P<0.05);与吉西他滨组相比，黄芪多糖+吉西他滨组Bcl-2、P62较低，Bax、Beclin-1以及LC3Ⅱ、LC3Ⅰ较高(P<0.05),见表2。

3、讨论

胰腺癌是以腹部不适、上腹痛、纳差为主要特征的疾病。研究发现，胰腺癌多发生于肝经，根据其阴阳消长之理，为阴气尽而阳气始生[7]。肝为刚脏，内寄相火则产生心脏疼痛、发热等症状，由此认为胰腺癌的中医辨证为肝阳虚，寒湿内盛。

中药具有较好的抗肿瘤作用，且不良反应小。黄芪在肿瘤治疗中发挥着关键作用，能抑制多种癌细胞的生长[8- 9]。本研究发现，黄芪多糖+吉西他滨组瘤体积、平均瘤质量均低于空白对照组、黄芪多糖组、吉西他滨组，抑瘤率较高；黄芪多糖+吉西他滨组肿瘤组织坏死率、TUNEL表达平均值均高于空白对照组、黄芪多糖组、吉西他滨组。出现这种情况的原因可能是因为黄芪多糖+吉西他滨组的共同用药有一定的协同抑瘤作用，同时也表明两种药物联用可产生明显的协同效应[10]。进一步研究表明，黄芪多糖可通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用。

本研究发现，与空白对照组相比，黄芪多糖组、吉西他滨组及黄芪多糖+吉西他滨组肿瘤组织Bcl-2、P62较低，Bax、Beclin-1以及LC3Ⅱ、LC3Ⅰ较高；与黄芪多糖组相比，吉西他滨组Bcl-2、P62较低，Bax、Beclin-1及LC3Ⅱ、LC3Ⅰ较高；与吉西他滨组相比，黄芪多糖+吉西他滨组Bcl-2、P62较低，Bax、Beclin-1以及LC3Ⅱ、LC3Ⅰ较高。出现这种情况的原因可能是因为Bcl-2能通过阻止程序性细胞死亡而参与肿瘤的形成。Bax是一个凋亡促进基因，可以直接促进细胞凋亡。Beclin1表达增强可作为评价自噬升高的重要指标。LC3分为Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型常规表达，游离存在于胞质中，而Ⅰ型LC3含量与自噬泡数量呈正比。Beclin-1基因缺失或点突变将使细胞凋亡能力明显降低而导致肿瘤。由此可见自噬活性的降低可能有利于某些肿瘤的发生。

综上所述，黄芪多糖能够有效抑制胰腺癌移植瘤生长，且与吉西他滨共同使用具有一定的增效作用，同时，自噬在胰腺癌细胞增殖中起到了保护肿瘤细胞的效果，通过调控自噬有可能对提高吉西他滨治疗该疾病的敏感性提供新靶点。

表1各组裸鼠的瘤体积、平均瘤质量、抑瘤率比较

表2各组裸鼠Bcl-2、Bax、Beclin-1、P62、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ蛋白表达比较

作者贡献声明邱萍：项目设计，撰写论文，数据分析；龚敏：动物造模；徐林芳：动物造模；王桂良：分子生物学实验；李佳玲：分子生物学实验；谢扬：审核数据

参考文献:

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