胰腺癌是最常见的恶性肿瘤。据估计,到2030年,胰腺癌可能超过乳腺癌,成为美国癌症死亡的第二大原因。胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)占胰腺常见恶性肿瘤的90%以上,患者5年相对生存率约为12%[1]。2020年,中国累计胰腺癌男性患者死亡病例为63 104例,女性患者死亡病例为37 323例。与2005年相比,2020年胰腺癌患者死亡总人数增加了87.1%[2]。目前,胰腺癌的治疗仍然面临着极大的挑战。因其早期一般没有特异性症状,发现时多已处于中晚期,错过了最佳的手术时期。同时,其强侵袭性和耐药性等特征也给治疗带来了巨大的难度。而转移晚期即便进行手术治疗也难以扭转患者的命运[3]。

糖基化是蛋白质常见的一种翻译后修饰,广泛存在于所有真核生物中。糖基化修饰是影响蛋白质折叠、稳定性和转运等的重要因素,参与调控肿瘤的发生、发展和转移等多个过程,在肿瘤生物学中具有重要作用[4,5]。蛋白质的糖基化修饰由复杂的生物合成途径产生,需要众多的酶、细胞器和其他因子互相协调作用。这个过程涉及数百种糖基转移酶、糖苷酶、转录因子、转运蛋白和蛋白质骨架等[6]。糖基转移酶的底物多样(包括单糖和低聚糖种类及结构的多样)导致载体蛋白结构呈现复杂的特征[7]。大多数糖基转移酶是II型跨膜糖蛋白,具有内质网和高尔基体腔定向催化结构域,可将活性糖核苷酸尿苷二磷酸–葡萄糖(UDP-Glc)、尿苷二磷酸-N-乙酰葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)、尿苷二磷酸–半乳糖(UDP-Gal)、尿苷二磷酸-N-乙酰半乳糖胺(UDP-GalNAc)、尿苷二磷酸–木糖(UDP-Xyl)、尿苷二磷酸–葡糖醛酸(UDP-GlcA)、鸟苷二磷酸–甘露糖(GDP-Man)、鸟苷二磷酸–岩藻糖(GDP-Fuc)、5'-单磷酸胞苷-N-乙酰神经氨基酸(CMP-NeuAc)和胞苷二磷酸–核糖醇(CDP-ribitol)作为供体转移到底物蛋白[8]。由蛋白质和单糖或多糖连接成的糖蛋白大多在内质网进行折叠、基础加工和糖基化修饰后,进一步由高尔基体加以修剪、延伸和末端糖基化。糖蛋白在通过囊泡进行分选后,一部分会经由衣被蛋白I(coat protein I,COPI)转运回到内质网,而另一部分则会被转运至质膜表面,执行多种功能,例如介导黏附、配体–受体结合、保护病原体以及提供毒素受体等功能[8,9]。

胰腺癌转移仍然是胰腺癌治疗过程中难以攻克的难题之一。胰腺癌具有高度转移性,并且缺乏有效的诊断标志物。糖类抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9,CA19-9),又称唾液酸Lewis a(sialyl Lewis a,sLea),是糖链的一种类型,已被确定为胰腺癌的生物标志物[10]。尽管CA19-9被用作胰腺癌的有效预测指标,但仍然存在特异性不强的缺陷,导致大多数患者在发现时已处于晚期[10]。有研究证明,糖基化参与了胰腺癌转移的过程,包括调控细胞的黏附、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)相互作用以及细胞信号转导等[11]。这些生物学功能会影响胰腺癌的侵袭、迁移或增强抗肿瘤T细胞的免疫能力。本综述重点阐述蛋白质的糖基化修饰介导胰腺癌转移的过程。此外,我们对靶向性治疗胰腺癌的糖基化蛋白质进行了展望。

1、糖基化的种类

蛋白质的糖基化修饰可依据糖和蛋白质的连接方式进行分类,在真核细胞中最为普遍的是N-糖基化和O-糖基化。由于供体糖在种类及构型上具备多样性,而与蛋白质连接的方法也多种多样,因此糖基化修饰在生物体内属于最为丰富的蛋白翻译后修饰之一。

1.1 N-glycosylation

N-糖基化过程始于内质网中的新生肽链[12],并在内质网中进行初步加工,初步加工的N-糖基化修饰产物被转移到高尔基体进一步加工成为成熟的N-聚糖[13,14]。N-聚糖的形成需要糖供体,其前体的合成是在内质网腔内由ALG(asparagine-linked glycosyltransferase)家族的糖基转移酶负责将脂质连接的寡糖连到嵌在膜上的磷酸多萜醇(Dol-P),经过ALG一系列催化形成Glc3Man9Glc NAc2-PP-Dol结构,这一结构作为供体用以形成N-糖链[15]。随后由内质网膜上的寡糖转移酶(oligosaccharyltransferase,OST)催化将Glc3Man9Glc NAc2以共价键β1键连接到多肽链中天冬酰胺(Asn)的-NH2自由基上,这种连接建立在特定的Asn-X-Ser/Thr序列上(其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸)。OST能够识别新生肽链序列上的-Asn-X-Thr/Ser-,从而将核心糖链转移到目的蛋白的Asn上。为了更好地识别受体序列,核心糖链转移到Asn的过程发生在蛋白质二硫键形成之前[16]。随后,含有N-糖链的蛋白质经内质网α-Glc介导的进一步修饰过程,去除糖链上的葡萄糖分子和1分子的甘露糖,从而形成含有糖链Glc NAc2Man8的蛋白质。紧接着,它们被转运到高尔基体被各种糖基转移酶和糖苷酶进一步延伸和修饰,形成高甘露糖型、复合型或杂合型这三种类型,使N-聚糖具有更高的复杂性(图1)[14,17]。这些复杂的N-聚糖末端包括N-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰半乳糖胺、唾液酸和岩藻糖,这些末端结构决定N-聚糖的类型,并且影响蛋白质的构象、抗原性、活性和识别,在生物体内发挥重要作用[18]。

图1 N-聚糖的生物合成

1.2 O-glycosylation

真核细胞中常见的两种O-糖基化形式为O-GlcNAc(O-linked-β-D-N-acetylglucosamine)和O-Gal NAc(Mucin-type O-glycosylation),它们的连接方式都是在丝氨酸或苏氨酸的羟基上添加糖链[19]。

O-GlcNAc是O-连接的β-N-乙酰葡糖胺修饰,在真核细胞中广泛分布,多发生于细胞核、细胞质和线粒体中,为单糖连接[19]。O-GlcNAc是一种高度动态的可逆修饰,由O-连接的N-乙酰氨基葡糖转移酶[O-linked N-acetylglucosamine (GlcNAc)t r a n s f e r a s e,O G T]和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(beta-N-acetylglucosaminidase,OGA)共同协调完成,OGT在底物中添加GlcNAc,OGA在底物中去除GlcNAc(图2A)[20]。其中,尿苷二磷酸-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-N-acetylglucosamine,UDP-GlcNAc)作为O-GlcNAc的供体糖,由葡萄糖经过己糖胺生物合成途径(hexosamine biosynthesis pathway,HBP)合成[21]。O-GlcNAc作为营养传感器和调节信号、转录和细胞代谢的主开关,在体内既能参与代谢和应激调节机制,也能够调节蛋白质酶活性和亚细胞定位等[22]。

O-GalNAc修饰通常以簇的形式出现[23]。由于黏蛋白含有大量丰富的O-GalNAc修饰识别的Ser/Thr序列,因此这种修饰也被称为黏蛋白类型修饰。这种修饰也发生在大多数膜蛋白以及分泌途径中的蛋白质上。细胞表面分泌的黏蛋白可作为细胞与外界环境交流的桥梁。同时,黏蛋白具有形成黏液屏障的功能,这种功能在抵抗病原体的入侵和免疫环境中具有重要作用[24,25]。黏蛋白型糖基化修饰过程在高尔基体中进行,由定位于高尔基体的20多种N-乙酰半乳糖氨基转移酶(GALNT)家族成员参与O-GalNAc型糖基化修饰。首先以UDP-GalNAc为供体底物将GalNAc连接到蛋白质的Ser或Thr残基上,形成简单的GalNAcO-Ser/Thr(Tn抗原)[26]。其次,由GalNAc-Ts添加GalNAc形成Tn抗原,再经过C1GalT1修饰,在Tn抗原上添加Gal,合成核心1(T抗原)[27]。在不同的成核酶催化作用下,Tn抗原和T抗原形成多种不同的O-糖结构。核心O-糖在其他酶修饰下可以进一步延长半乳糖、岩藻糖和唾液酸,它们通过α-或β-糖苷键连接形成线性或支链结构(图2B)[28]。最后,O-GalNAc修饰的蛋白加帽封顶主要是通过ST3GAL和ST6GAL唾液酸转移酶添加唾液酸来实现的,这些步骤在顺式高尔基体和反式高尔基体中逐步进行,而部分O-GalNAcylation修饰的分泌蛋白,如MUC5AC,会继续通过囊泡完成最后的分泌过程[29]。

图2 O-聚糖的生物合成

2、糖基化在胰腺癌转移中的作用

胰腺癌转移是上皮–间充质转化(epithelialmesenchymal transition,EMT)和肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)等共同作用的结果,涉及结缔组织增生、免疫抑制、ECM和血管生成等过程的相互影响[30]。转移的途径主要是局部浸润和淋巴转移,最终导致肝和肺等器官的远端转移[31]。异常糖基化主要通过控制致癌过程中的主要蛋白成分,导致载体蛋白功能丧失,从而促进肿瘤的发展;进而导致胰腺癌出现信号通路异常激活和转移等表型。

2.1 N-glycosylation在胰腺癌转移中作用

2.1.1 N-glycosylation总体水平变化

N-聚糖通过影响细胞内信号来介导胰腺癌细胞转移。有研究发现,4F2hc的N-糖基化减少会损害谷氨酸–胱氨酸抗转运系统的活性来增强PDAC细胞铁死亡致敏性进而抑制PDAC细胞的迁移[32]。p65活性的升高促进了B4GALT1对CDKp110的N-糖基化修饰从而稳定了其表达,并提高了胰腺癌细胞对吉西他滨的耐药性,同时促进了其增殖、迁移和侵袭等生理过程[33]。另外,UGP2的下调导致EGFR及其他蛋白质的N-糖基化修饰减少,损害了EGFR信号转导,从而抑制了PDAC生长和转移[34]。N-糖基化的CGA-T1过表达上调了磷酸化Akt(p-Akt)和磷酸化mTOR(p-mTOR)的表达水平,并通过PI3K/Akt/m TOR通路部分抑制了自噬的启动,从而发挥了抑制胰腺癌的作用[35]。细胞外gal4通过结合CD3ε/δ上的N-糖基化残基诱导T细胞凋亡和抑制细胞增殖[36]。这些都表明,N-糖基化修饰在胰腺癌的转移中有着重要作用。

2.1.2糖链的分支数量变化

胰腺癌早期转移的关键因素包括EMT和TME的改变。其中,EMT是极性上皮细胞转化为间充质细胞的过程,赋予胰腺癌细胞显著的迁移和侵袭周围组织的能力[37]。在转移的PDAC中,N-糖基化丰度升高。肝转移中高甘露糖型的N-聚糖增加最为明显,转移能力较强的间充质样PaTu-T细胞中高甘露糖型的N-聚糖水平高于上皮样PaTu-S细胞[38]。N-聚糖复杂多样,其支链类型包括β1,6-GlcNAc分支化、平分型GlcNAc、唾液酸的盖帽修饰和核心糖链的岩藻糖基化等,这些支链也不同程度地促进了EMT进程[39]。例如,ST6GAL1在转移性亚克隆胰腺癌细胞系中高表达,这些细胞还表现出间充质标志物(N-cadherin、slug、snail和fibronectin)的蛋白水平升高和很强的细胞侵袭性[40]。另外,ST6GAL1介导的唾液酸化也能激活EGFR信号从而促进腺泡向导管化生[41]。

2.1.3岩藻糖修饰水平变化

岩藻糖基化修饰的改变也是胰腺癌转移中常检测到的指标之一,在N-糖链合成过程中,FUT8(fucosyltransferase 8)是唯一催化核心岩藻糖基化的酶。有研究表明,在异种移植模型中,FUT8敲低显著降低了PDAC细胞系的侵袭能力,并抑制了其腹膜转移[42]。还有研究利用Aleuria aurantia凝集素(Aleuria aurantia lectin,AAL)和米曲霉L-岩藻糖特异性凝集素(Aspergillus oryzae lectin,AOL)检测FUT8修饰的α-1,6-岩藻糖基化,发现其在导管内胰腺黏液性肿瘤中上调,并且可能与恶性转化有关[43]。此外,肿瘤细胞中岩藻糖基化修饰水平增加会导致PDAC转移增加。而这种修饰水平的变化可作为区分转移性和非转移性PDAC细胞的依据[44]。

2.1.4唾液酸修饰水平变化

早期的研究发现细胞表面唾液酸化是癌细胞转移的一个重要特征,并且在PDAC患者血清中唾液酸化部分上调[45],暗示Lewis x抗原过表达后与选择素大量结合可能是PDAC术后出现大量肝转移的原因[46]。PDAC含有丰富的基质和多种炎症因子,炎症因子的刺激可以增加肿瘤相关唾液酸化抗原SLe(x)和Le(y)的表达水平[47]。相应地,唾液酸调节单核细胞产生IL-10和IL-6,随后通过激活Siglec-9受体驱动单核细胞极化和分化为免疫抑制性TAM(tumour-associated macrophage),从而促进PDAC的免疫抑制[48]。这表明PDAC的糖基化与微环境内的各种成分相互调节,共同促进肿瘤进程。

2.2 O-glycosylation在胰腺癌转移中的作用

2.2.1 O-GlcNAc修饰在胰腺癌转移中的作用

OGlcNAc修饰除了参与癌细胞的代谢重编程外,还与胰腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭和转移相关[49]。在胰腺癌中,存在异常高表达的OGT和高水平的O-Glc NAc修饰,而O-Glc NAc修饰主要通过介导细胞内信号转导来促进肿瘤的进程。例如,抑制OGT特异性减弱O-Glc NAc修饰进而影响肿瘤转移等表型,利用雷公藤内酯处理下调OGT从而减弱β-catenin的O-GlcNAc修饰,抑制β-catenin核转运,导致TCF/LEF1介导的下游基因的表达下调,从而抑制胰腺癌的进展[50]。OGT通过在SIRT7的S136位点引发O-Glc NAc修饰,抑制SIRT7和REGγ之间的相互作用,从而达到稳定SIRT7表达以及促进胰腺癌进展的作用[51]。EOGT-SHCBP1复合物调节NOTCH1的O-Glc NAc修饰,并促进NICD核定位,进一步调节E-钙黏蛋白和p21基因的转录来促进PDAC细胞的侵袭和转移[52]。GFPT2促进了PDAC中YBX1的O-GlcNAc修饰和核易位。核易位的YBX1促进了IL-18的转录,从而促进巨噬细胞的M2极化和PDAC的恶性转移[53]。

2.2.2 O-GalNAc修饰在胰腺癌转移中的作用

胰腺癌中Mucin蛋白糖基化最显著的变化和特征是O-聚糖的截短包括T、Tn、STn(sialy-Tn)和sialy-T抗原的变化[54]。糖基转移酶表达的改变是黏蛋白聚糖异常变化的主要原因,其中胰腺癌肿瘤样本中糖基转移酶GCNT3、GALNT5、FUT3、B3GNT6和B3GNT3过表达超过19倍,并且它们在转移性的胰腺癌细胞系中有不同的作用[55]。另外,C1GALT1作为O-GalNAc合成过程中的主要T-合酶,与它的特异性伴侣COSMC共同作用,确保了黏附蛋白的O-GalNAc修饰,并且C1GALT1与胰腺癌患者的总生存期呈负相关[56]。C1GALT1可能通过影响整合素(包括β1、αv和α5亚基)的O-GalNAc来增强胰腺癌细胞迁移和侵袭[56]。在敲除COSMC的细胞系中,O-GalNAc糖蛋白诱导了Tn抗原的表达。这种表达的异常重塑了胰腺癌特性,表现为细胞增殖能力下降,迁移行为增加和凋亡减少[57]。

在胰腺癌的转移中,O-GalNAc糖基化通过跨膜黏附蛋白(例如CD44、MUC4和MUC16)发挥促转移作用,它们在介导细胞ECM黏附中有重要作用[58,59,60]。CD44的截短Tn抗原通过激活NF-κB信号通路,增加胰腺癌干细胞CSC(cancer stem cell)的干性特征和NANOG的表达水平,从而促进胰腺癌的转移[58]。还有研究表明,GALNT1增强CD44的Tn抗原修饰能激活Wnt/β-catenin信号通路以增加恶性肿瘤转移和侵袭的能力[61]。另外,β-catenin与TCF4协同调控PDAC中MUC4的转录活性,从而影响PDAC细胞的迁移和间充质特性[62]。STn抗原的异常表达也是胰腺癌中Mucin蛋白糖基化的显著变化之一。有研究表明,STn抗原在胰腺上皮内瘤变(PanlN-3)和浸润性导管腺癌中的表达水平显著增加[63],且在胰腺癌肝转移和肺转移组织中的表达水平也升高[64],与患者低生存率相关。在机制上,STn抗原通过调控Siglec-7和Siglec-9的信号转导途径影响单核细胞向巨噬细胞的分化进程,从而介导免疫抑制反应的发生[48]。这些都表明了O-GalNAc糖基化在胰腺癌转移中有重要作用。

3、靶向胰腺癌转移治疗中的蛋白质糖基化

免疫疗法是治疗胰腺癌的重要手段之一。过继细胞转移(adoptive cell therapy,ACT)和免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitor,ICI)在临床上已经展现出不同的治疗效果,但只有少数患者能够受益[65]。嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法作为ACT的一种形式,近年来不断进行技术更新并在临床上取得显著进展。据报道,异常N-糖基化会增加细胞对CAR-T疗法的抗性,SPPL19的缺失使CD19N125位点出现高糖基化,使得CAR-T细胞衰竭并导致CART19疗效下降[66]。2DG抑制己糖激酶以阻断N-聚糖合成途径,可显著增强44v6.28ζ CARs的细胞杀伤作用,进而有效抑制肿瘤生长和转移[67,68,69]。另外,在CAR中掺入聚糖使其成为能识别高甘露糖型的H84T-CAR,并靶向凝集素将其治疗活性扩展到恶性细胞及其支持基质细胞,从而破坏TME[70]。综上所述,肿瘤细胞的蛋白糖基化修饰可以作为CAR-T细胞治疗的靶点并具有良好的疗效。

免疫检查点与蛋白质的糖基化修饰存在紧密关联,阻断免疫检查点可以显著改善患者预后。单克隆抗体AR9.6靶向胰腺癌中MUC16,将muAR9.6与新兴免疫检查点抑制剂相结合,可有望针对性治疗胰腺癌[71]。CD24特异性单克隆SWA11疗法有效地阻止了异种移植小鼠的肺和胰腺肿瘤侵袭[72]。胰腺癌中大部分Siglec受体是抑制性受体,唾液酸作为免疫细胞上抑制性Siglec受体的配体,抑制其相互作用是新的潜在免疫治疗方法[73]。PS-1 CAF衍生的唾液酸部分通过与Siglec-9结合来促进TAM分化和极化,形成免疫抑制表型[74]。总体而言,糖基化修饰的改变在治疗胰腺癌转移中具有巨大的潜力,但需要进一步探索以了解如何利用这些靶点治疗PDAC。

4、总结和展望

糖基化是最常见的蛋白质翻译后修饰之一,参与细胞黏附、增殖和信号转导等生物学过程,而这些过程与胰腺癌的转移密不可分。炎症反应、免疫微环境的改变和EMT参与导致胰腺癌中糖基化的总体水平以及糖型和构型的改变,从而促进胰腺癌的发展。有证据表明,胰腺癌的早期诊断能大大提高病人的生存率,例如碳水化合物CA19-9是目前胰腺癌诊断最佳的生物标志物,可以用于评估分期、预后、肿瘤可切除性以及肿瘤复发和治疗效果,是胰腺癌治疗中良好的监测工具[10]。现在大多数的研究聚集在血清里糖蛋白或者糖基化修饰的变化,并且在胰腺癌早期患者血清中确实检测观察到蛋白质糖基化修饰的异常变化,包括岩藻糖基化、聚LacNAc分支变化和特殊唾液酸糖基化的变化[75,76]。利用附着在Janus纳米颗粒(Janus nanoparticles,JNPs)上的凝集素在无抗体的情况下靶向外泌体聚糖,其中凝集素对岩藻糖和唾液酸具有高特异性和高亲和力,为评估胰腺癌的转移提供了参考[77]。然而,聚糖在胰腺癌转移中具体功能和机制还要进一步的研究。深入研究聚糖的应用潜力,发掘其靶向胰腺导管腺癌的治疗方法,在临床实践中有重要意义。

免疫检查点分子异常的糖基化修饰使肿瘤细胞规避免疫系统的监视进而实现免疫逃避,从而促进肿瘤转移,揭示了糖基化在此过程中的重要作用。尽管靶向糖基化蛋白的治疗取得了卓越的成绩,但障碍和挑战依然存在:糖基化修饰的多样化和构象的复杂性使得我们对它的了解还很少,如何合理利用特异性糖基化来治疗疾病是我们面临的极大挑战之一。另外随着检测能力的提高,检测糖基化方式的改变使得研发靶向糖基化修饰的蛋白治疗方法增多。随着其他高度特异性抗体的研发,该方法可能成为临床中治疗诊断常用的手段,并且能最快时间得到诊断结果。蛋白质糖基化修饰具有多样的合成途径和广泛的分布特点,赋予了蛋白质特定的功能。其功能性决定了其有望在癌症治疗中成为新靶标。但这些治疗方法在患者诊断、预后和治疗中存在许多局限性,这些问题仍需进一步研究加以解决。

本文综述了蛋白质的异常糖基化修饰参与胰腺癌转移的机制,包括EMT和TME等过程。但是,我们对这一领域的认识依然有限。了解胰腺癌转移中的异常糖基化改变,结合新的预测标志物和治疗方法,将为创新治疗策略提供重要参考。

基金资助:国家自然科学基金(批准号:82273970､82304561)资助的课题~~;

文章来源:韦倩,陈家思,吕浩,等.蛋白质糖基化修饰在胰腺癌转移中的作用[J].中国细胞生物学学报,2024,46(06):1220-1228.