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异甘草素对小鼠运动性疲劳和氧化应激能力的影响

2024-07-19 9 上传者：管理员

摘要：目的探究异甘草素对小鼠运动性疲劳和氧化应激的影响。方法用游泳训练方法建立运动性疲劳小鼠模型。将50只造模成功小鼠随机分为模型组、阳性对照和低、中、高剂量实验组，每组10只；另取10只正常小鼠作为正常组。正常组和模型组均灌胃给予等剂量0.9%NaCl;低、中、高剂量实验组分别灌胃给予10、20、40 mg·kg-1异甘草素；阳性对照组灌胃给予200 mg·kg-1红景天西洋参。6组大鼠每天灌胃给药1次，连续给药6周。用试剂盒检测丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性，用蛋白质印迹法检测过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α（PGC-1α）和雌激素受体相关受体α（ERRα）蛋白的表达水平。结果中、高剂量实验组和阳性对照组、模型组、正常组的MDA分别为（8.55±0.42）、（4.76±0.33）、（5.11±0.55）、（13.45±1.32）和（2.78±0.46）nmol·mg-1,SOD活性分别为（53.42±5.89）、（65.37±6.19）、（63.24±7.52）、（33.43±4.57）和（79.52±8.95）U·mg-1,GSH-Px活性分别为（72.89±6.99）、（97.89±10.24）、（99.74±11.65）、（48.42±4.35）和（108.47±11.54）U·mg-1,PGC-1α蛋白相对表达水平分别为0.52±0.07、0.75±0.06、0.73±0.10、0.23±0.04和0.83±0.08,ERRα蛋白相对表达水平分别为0.46±0.04、0.62±0.07、0.65±0.09、0.19±0.04和0.77±0.05;中、高剂量实验组和阳性对照组的上述指标与模型组比较，在统计学上差异均有统计学意义（均P<0.05）。结论异甘草素具有缓解小鼠缓解运动性疲劳和氧化应激的能力，其机制与PGC-1α、ERRα有关。

关键词：
异甘草素
氧化应激
线粒体呼吸链
运动性疲劳
骨骼肌
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运动性疲劳主要是运动引起肌肉最大输出功率暂时性降低或最大收缩的生理现象[1]。运动性疲劳是人体运动正常生理现象，在运动过程中达到一定强度训练，可引起机体发生剧烈变化，若不及时休息，身体运动系统中肌肉和骨骼肌受到内外压力，导致肌肉和骨骼肌出现运动性损伤[2,3]。异甘草素是从中药甘草内提取的一种黄酮类化合物，具有广泛药理活性，如抗炎、抗氧化、抗肿瘤等[4],其还可提高小鼠心肌缺血再灌注抗氧化能力，也有利于心功能恢复[5]。本研究通过构建运动性疲劳小鼠模型，探究异甘草素对小鼠运动性疲劳、氧化应激的影响。

一、材料与方法

1 材料

动物SPF级雄性Balb/c小鼠，鼠龄8周，体质量18～22 g, 购自北京维通利华实验动物公司。动物生产许可证号：SCXK(京)2021-0009。本实验经郑州大学动物伦理委员会批准(伦理批号：20201002369)。

药物与试剂异甘草素，纯度：≥98%,批号：B21525,购自上海源叶生物公司；红景天西洋参胶囊，规格：每粒360 mg, 批号：20220511,批准文号：国食健字G20100581,广州市赛健生物科技有限公司生产。乳酸、尿素氮、睾酮、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)试剂盒，均购自上海酶研公司；肝糖原试剂盒，购自上海雅吉生物科技有限公司；谷胱甘肽过氧化物酶(gluta-thione peroxidase, GSH-Px)试剂盒，购自上海瓦兰生物科技有限公司；线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ试剂盒，均购自艾美捷科技有限公司；过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α(peroxisome proli-ferator activating receptor-gamma coactivator-1α,PGC-1α)抗体、雌激素受体相关受体α(estrogen receptor-associated receptor alpha, ERRα)抗体，均购自美国Thermo Fisher公司；羊抗兔二抗，购自武汉艾美捷公司。

仪器UV-2540分光光度计，日本SHIMAZDU公司产品；Varioskan LUX多功能酶标仪，美国Thermofisher公司产品；ELITE 300PLUS电泳仪、Yrdimes SW07D0567蛋白印迹仪，均为美国Wealtec公司产品。

2 实验方法

2.1 溶液配制

取异甘草素100 mg, 溶于0.9%NaCl 20 mL,配制成质量浓度为5.0 mg·mL-1的异甘草素溶液；取红景天西洋参胶囊粉末适量，溶于0.9%NaCl 25 mL,配制成质量浓度为200 mg·mL-1的红景天西洋参溶液；上述2种溶液均现配现用，避光常温保存。

2.2 模型构建

参考文献[6]的方法构建运动性疲劳小鼠模型。制定6周游泳训练计划，每周训练6 d, 休息1 d。选择1个长、宽、高为80 cm×60 cm×70 cm塑料盒子作为游泳槽，水深为30 cm, 水温(30±2)℃,在小鼠尾部系上其体质量5%铅球，进行游泳训练，记录小鼠负重游泳时间。力竭评估标准：小鼠在水中运动、旋转协调性不佳，身体下沉，淹没至鼻尖10 s未浮出水面。

2.3 动物分组与给药方法

将50只造模成功小鼠分为模型组、阳性对照组和低、中、高剂量实验组，每组10只，并选取10只小鼠作为正常组。正常组、模型组均灌胃等剂量0.9%NaCl, 低、中、高剂量实验组分别灌胃10、20、40 mg·kg-1的异甘草素溶液，阳性对照组给予200 mg·kg-1的红景天西洋参溶液。6组大鼠每天灌胃给药1次，连续给药6周。

2.4 酶联免疫吸附试验法检测运动性疲劳指标和氧化应激指标[7,8]7-8]

末次给药12 h后，麻醉处死小鼠，取股四头肌组织，用0.9%NaCl冲洗，滤纸擦干，按照1∶9(组织-0.9%NaCl)比例制备匀浆液，以2 500 r·min-1离心15 min, 取上清液。严格按照试剂盒说明书的步骤进行操作，用酶联免疫吸附试验法检测乳酸、尿素氮、睾酮和肝糖原的水平，用二硫代二硝基苯甲酸法检测GSH-Px活性，用嘌呤氧化酶法检测SOD活性，用硫代巴比妥酸法检测MDA含量。

2.5 比色方法检测线粒体呼吸链酶复合物活性[9]9]

取小鼠股四头肌组织，剪碎，按照1∶5加入A溶液内(0.1 mmol·L-1 KCl、0.05 mmol·L-1 Tris-HCl、pH 7.4),以2 000 r·min-1离心10 min, 取上清液，离心2次；以1.2×104 r·min-1离心15 min, 沉淀物即骨骼肌线粒体。将A溶液加入B溶液内(20 mmol·L-1 Tris-HCl、300 mmol·L-1蔗糖、0.1% BSA、pH=7.2)用于悬浮培养，获得纯化后的线粒体。取线粒体悬浮液，加入酶复合物相关缓冲液，参考线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ～Ⅲ试剂盒说明书的步骤进行操作，用酶标仪分别在340、600、550 nm波长处检测光密度值。

2.6 蛋白质印迹法检测PGC-1α和ERRα蛋白的表达水平[10]10]

将RIPA裂解液加入小鼠股四头肌组织中，用BCA法测定蛋白浓度。取蛋白样品40 μg经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移至PVDF膜，封闭培养在含5%脱脂奶粉内60 min, 加一抗PGC-1α、ERRα、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗体，4 ℃过夜孵育，与二抗稀释液室温孵育60 min, 最后在PVDF膜上添加化学发光试剂，显色、曝光，用Image J软件分析蛋白条带灰度值。

3 统计学处理

用SPSS 25.0软件进行统计分析。计量资料用

表示，多组间比较用单因素方差分析，组内比较用LSD-t检验。

二、结果

1 6组小鼠负重游泳时间的比较

低、中、高剂量实验组分别给予10、20、40 mg·kg-1的异甘草素溶液；阳性对照组给予200 mg·kg-1红景天西洋参溶液；正常组、模型组均给予等剂量0.9%NaCl。

低、中、高剂量实验组和阳性对照组、模型组和正常组小鼠的负重游泳时间分别为(83.70±9.75)、(94.50±10.21)、(106.81±11.24)、(110.32±15.32)、(78.10±6.98)和(119.71±16.35)min。模型组小鼠的负重游泳时间较正常组显著降低，在统计学上差异有统计学意义(P<0.05);低、中、高剂量实验组和阳性对照组小鼠的负重游泳时间均较模型组显著升高，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。

2 6组小鼠运动性疲劳和氧化应激相关指标比较

模型组与正常组比较，乳酸和尿素氮、MDA含量均显著升高，睾酮、肝糖原、SOD活性、GSH-Px活性均显著降低，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05);低、中、高剂量实验组、阳性对照组小鼠的乳酸、尿素氮、MDA含量均较模型组显著降低，睾酮、肝糖原、SOD活性、GSH-Px活性均较模型组显著升高，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结果见表1。

表1 6组小鼠运动性疲劳和氧化应激相关指标的比较

3 6组小鼠骨骼肌组织线粒体呼吸链酶复合物比较

模型组小鼠骨骼肌线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ活性均较正常组显著降低，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05);低、中、高剂量实验组和阳性对照组小鼠骨骼肌线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ活性均较模型组显著升高，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结果见表2。

4 6组小鼠骨骼肌组织线粒体相关蛋白表达比较

如图1所示：低、中、高剂量实验组和阳性对照组、模型组、正常组的PGC-1α蛋白相对表达水平分别为0.40±0.05、0.52±0.07、0.75±0.06、0.73±0.10、0.23±0.04和0.83±0.08,ERRα蛋白相对表达水平分别为0.29±0.05、0.46±0.04、0.62±0.07、0.65±0.09、0.19±0.04和0.77±0.05。模型组小鼠骨骼肌组织中PGC-1α、ERRα蛋白相对表达水平均较正常组显著降低，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05);低、中、高剂量实验组和阳性对照组小鼠骨骼肌组织中PGC-1α、ERRα蛋白相对表达水平均较模型组显著升高，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。

表2 6组小鼠骨骼肌线粒体中呼吸链复合物活性的比较

图1 6组小鼠骨骼肌组织中过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α(PGC-1α)和雌激素受体相关受体α(ERRα)蛋白的表达情况

三、讨论

运动性疲劳是运动训练后常见的一种生理现象[11]。目前，研究认为，能量代谢消耗、代谢物质累积、氧化应激等是影响运动性疲劳的关键因素，疲劳直接表现为运动耐力下降，而负重游泳实验、跑轮实验等是常用模拟疲劳动物模型的方法[12,13,14]。

在运动训练时，主要靠糖酵解获得能量，超负荷运动能促进机体消耗大量蛋白质，分解过多代谢产物，直接表现出运动耐力降低，引发运动性疲劳[15]。长期强烈运动加剧体内耗氧量增加，骨骼肌、心脏等组织脂质过氧化能力增强，导致自由基产生过多，促进机体发生氧化应激[16]。乳酸和尿素氮是2种重要的疲劳相关指标。乳酸堆积会影响肌肉收缩性，引起肌肉酸痛和疲劳，而尿素氮水平升高则反映了肌肉释放氨的程度增加，蛋白质分解增多。MDA是最常见的膜脂过氧化产物，反映机体氧化应激强度。血睾酮水平反映机体内分泌功能和竞技状态。SOD和GSH-Px是2种重要的抗氧化酶，SOD可将超氧阴离子转化为过氧化氢，并在过氧化氢酶的作用下最终生成水。GSH-Px能够将有毒的过氧化物还原为无毒的羟基化合物，起到保护细胞免受过氧化物损害的作用。本研究通过构建小鼠运动性疲劳模型，结果发现，在模型组内小鼠乳酸、尿素氮、MDA含量均明显升高，而睾酮、SOD、GSH-Px活性均明显降低，与杨芳芳[9]研究结果相似，这表明模型构建成功。

异甘草素是一种天然黄酮类化合物，具有明显抗炎、抗氧化、保护组织等活性[17]。已有研究显示，黄酮类化合物有明显缓解运动性疲劳的作用，并能改善机体能量代谢[18]。本研究给予小鼠灌胃不同剂量异甘草素后发现，异甘草素呈剂量效应关系改善小鼠骨骼肌组织疲劳和氧化应激相关指标，增强机体自由基清除能力，减少脂质过氧化物生成，表明异甘草素可有效缓解小鼠运动性疲劳，并提高其抗氧化能力。

线粒体结构异常、功能障碍也是疲劳产生的关键因素，而线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ活性高低可间接反映线粒体呼吸功能变化[19]。PGC-1α是线粒体合成、能量代谢的关键因子，也是决定线粒体合成中发生氧化磷酸化的首要因素。当PGC-1α活化后，可激活下游靶基因ERRα,二者共同激活可促进线粒体功能恢复[20,21]。有研究显示，PGC-1α、ERRα表达水平上调能提高线粒体合成能力，增强骨骼肌抗疲劳、抗氧化能力[22]。本研究结果显示，模型组的线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ活性均显著降低，PGC-1α、ERRα蛋白表达水平均显著下调，给予运动性疲劳小鼠异甘草素后，小鼠骨骼肌线粒体功能得到显著改善，且呈剂量依赖性。

本研究提示：异甘草素可减轻小鼠运动性疲劳，并提高骨骼肌抗氧化能力，其作用机制可能与改善骨骼肌氧化应激、线粒体功能有关，这为异甘草素抗疲劳的研究提供参考，但其具体作用机制有待进一步研究。

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