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水蛭素对脓毒症大鼠血小板功能的影响

2024-07-23 6 上传者：管理员

摘要：目的研究水蛭素对脓毒症大鼠血小板功能的影响。方法将45只大鼠分为假手术组、模型组和水蛭素组。术后6 h和24 h对三组大鼠进行采血并检测血小板计数、血小板聚集率和P-选择素表达率水平。结果水蛭素组术后6 h血小板计数较模型组下降（P<0.05）。模型组术后24 h血小板计数较水蛭素组和假手术组降低（P<0.05），但假手术组术后24 h血小板计数较水蛭素组明显上升（P<0.05）。模型组术后6 h血小板聚集率较假手术组和水蛭素组升高（P<0.05），而水蛭素组术后6 h血小板聚集率较假手术组明显更高（P<0.05）。假手术组术后24 h血小板聚集率较模型组及水蛭素组明显更高（P<0.05）。水蛭素组术后24 h血小板聚集率较模型组更高（P<0.05）。术后6 h及24 h，模型组P-选择素表达率较假手术组及水蛭素组明显增加（P<0.05）。水蛭素组术后6 h及24 h的P-选择素表达率较假手术组更高（P<0.05）。结论水蛭素能提高脓毒症大鼠的血小板数量，增强聚集功能并下调P-选择素表达水平以发挥抗炎作用。

关键词：
中医药
并发症
水蛭素
脓毒症
血小板
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脓毒症是宿主因感染失控及免疫反应过激所致的危及生命的器官功能障碍，是严重烧、创伤及外科大手术等各种危重疾病的常见并发症[1,2]，其患病率、致残率及病死率均较高。既往研究[3-5]发现，血小板直接参与调节宿主因微生物感染所致的炎症反应及凝血过程。脓毒症发生时，血小板的黏附及聚集等功能变化对炎症失控、器官功能损害及组织损伤发挥着重要的作用[6]。既往有临床研究[7-9]显示，脓毒症发生时血小板聚集功能改变及血小板计数进行性下降，往往预示病情加重及预后不良。水蛭素是中药水蛭已提取的所有活性成分中活性最显著的一种，其相对分子质量约7000，含有6个三维结构，具有结构稳定、活性显著、难失活等特点。现代医学研究[10]发现，水蛭素具有抗凝、抗血栓及调节微血管再生等作用。本研究旨在观察水蛭素对脓毒症大鼠血小板功能的影响。

1、材料与方法

1.1 实验动物

收集45只2月龄SD大鼠[长沙市天勤生物技术有限公司，合格证书：SCXK（湘2019-0014）]，体质量（221.4±6.1)g。大鼠环境适养3 d。

1.2 主要仪器与试剂

水蛭素（上海源叶生物科技有限公司，s31625),10%水合氯醛（中国人民解放军第一七五医院），P-选择素抗体（Bioss生物公司）。CytoFLEX型流式细胞仪和Coulter-JT型全自动血小板分析仪均购于美国库尔特仪器公司。

1.3 实验方法

45只大鼠随机分为三组，即假手术组、模型组和水蛭素组，各15只。

1.3.1 脓毒症模型制备

除假手术组，余组均用盲肠结扎穿孔法建立脓毒症模型。造模方法：术前禁食12 h，使用10%水合氯醛麻醉；麻醉成功后，消毒腹部并于腹中线处切开长约1 cm的切口，探查盲肠；在距回盲部1/2处结扎盲肠并用无菌针头多次穿通，挤压盲肠使少量内容物挤出；还纳盲肠，逐层缝合关闭腹腔。

1.3.2 分组给药

每组随机抽取10只大鼠，用于观察24 h生存率。假手术组术后腹腔注射等量生理盐水，每天1次；模型组术后腹腔注射等量生理盐水，每天1次；水蛭素组术后腹腔注射水蛭素[1 mg/（kg·d）]。三组均按时间点取血标本。水蛭素溶液配置方法：取1 mL重组水蛭素浓缩液（10 mg/mL），溶于9 mL的生理盐水，充分摇匀，配制成1 mg/mL的原液，4℃避光保存备用。使用时用生理盐水稀释成所需浓度。

1.4 检测指标

(1）生存率：观察三组大鼠术后24 h生存率。（2）血小板计数：采用Coulter-JT全自动血小板分析检测仪检测。（3）血小板聚集率：以离心半径13.5 cm、转速800 r/min离心血标本约5 min，取0.3 mL左右富含血小板血浆的上清液，加入二磷酸腺苷（美国Sigma公司，批号：98H7027)10μL，至最终浓度为20μmol/L，使用540型血小板聚集仪（美国CHRONO-LOG公司）检测。（4）血小板P-选择素表达水平：取血标本约1 mL并加入7%的枸橼酸葡萄糖溶液（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），以离心半径13.5 cm、转速800 r/min离心5 min去污，获得富含血小板的血浆；取适量血浆加入抗体P-选择素-FITC，室温避光孵育1 h；再次离心5 min（条件同上），去上清液；使用1 mL的PBS溶液（北京索莱宝科技有限公司，批号：2306002）重悬，立即上机并测定。

1.5 统计学方法

采用SPSS 26.0统计学软件分析，计量资料以（±s）表示，多组间比较行单因素方差分析、LSD法，三组大鼠生存率行生存分析Kaplan-Meier法比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 术后24 h生存率

术后24 h，假手术组、模型组和水蛭素组大鼠生存率分别为100%、40%和80%，水蛭素组明显较模型组更高，差异有统计学意义（P<0.05）。这表明水蛭素能够降低脓毒症大鼠24 h病死率。见图1。

图1 三组大鼠术后24 h生存率

2.2 血小板计数

术后6 h，模型组大鼠血小板数量明显高于水蛭素组，差异有统计学意义（P<0.05）；但与假手术组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。术后24 h，模型组血小板计数明显较术后6 h减少且明显低于假手术组，水蛭素组明显高于模型组但低于假手术组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 三组大鼠血小板计数比较

2.3 血小板聚集率

术后6 h，模型组大鼠的血小板聚集率高于假手术组，水蛭素组低于模型组但高于假手术组，差异均有统计学意义（P<0.05）。术后24 h，模型组、水蛭素组血小板聚集率均低于术后6 h，且模型组低于假手术组，水蛭素组高于模型组但低于假手术组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 三组大鼠血小板聚集率比较

2.4 血小板P-选择素表达水平

术后6 h，模型组大鼠血小板P-选择素水平高于假手术组，水蛭素组低于模型组但高于假手术组，差异均有统计学意义（P<0.05）。术后24 h，三组血小板P-选择素水平与术后6 h比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；但模型组高于假手术组，水蛭素组低于模型组但高于假手术组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表3 三组大鼠血小板P-选择素表达水平比较

3、讨论

脓毒症是临床危重症的常见并发症，其发病涉及机体多系统、多器官病理生理的改变。目前全球范围内脓毒症的患病率和病死率仍逐年增加。据统计[11]，脓毒症仍是美国及欧洲地区患者死亡的首要原因，住院病死率更是高达30%～50%，严重威胁人类健康。近年来，国家大力发展中医药事业，中医药治疗脓毒症具有优势与特色，可多靶点、多途径共同发挥治疗作用，是当前研究热点。文献[12]报道，水蛭素能有效抑制血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α）、白细胞介素-6(IL-6）和白细胞介素-1β(IL-1β）的表达水平，下调核转录因子NF-κB p65的转录活性，从而发挥抗炎作用。但水蛭素对血小板功能的作用鲜有报道。

本研究采用盲肠结扎手术建立大鼠脓毒症模型，并选择术后24 h作为观察终点。经盲肠结扎术后，大鼠出现精神萎靡、活动差、血小板计数持续降低、脏器功能出现损伤及死亡率明显升高等，提示造模成功。本研究发现，水蛭素能上调盲肠结扎术后脓毒症大鼠的血小板计数、降低24 h病死率，机制可能与水蛭素的抗炎等作用密切相关。

血小板具有黏附、聚集和分泌等基本功能。脓毒症时，血小板被活化，通过黏附、聚集及分泌大量的炎症物质和凝血因子入血，直接参与机体的炎症及凝血反应等病理生理过程，从而发挥抗感染、清除病原体及止血等功能[13]。P-选择素为血小板活化的重要标志，当血小板受到炎症介质刺激时，迅速在表面表达P-选择素，从而介导血小板或内皮细胞与白细胞的相互黏附，参与炎症及血栓形成[14]。本研究发现，模型组术后6 h的血小板计数及聚集率较假手术组更高，而术后24 h低于假手术组，提示脓毒症的血小板计数及聚集功能表现为先升高再下降。水蛭素组术后6 h的血小板计数和聚集功能低于模型组，但术后24 h高于模型组，表明其可下调脓毒症早期的血小板数量和聚集功能，同时减轻后期的下降情况。模型组术后6 h及24 h的P-选择素水平较假手术组更高，说明脓毒症时，血小板分泌功能增强。水蛭素组术后6 h及24 h的P-选择素水平较模型组更低，说明其能抑制P-选择素表达，减弱血小板分泌功能，从而发挥抗炎作用。

综上所述，水蛭素能提高脓毒症大鼠的血小板数量，增强血小板聚集功能并下调P-选择素表达水平，从而发挥抗炎作用，以改善大鼠的生存率，但具体作用机制尚待进一步研究。

参考文献:

[9]钟林翠,宋景春,姜峻,等.血小板聚集率在评价脓毒症患者血小板功能及预后中的价值[J].东南国防医药,2020,22(3):249-253.

[10]徐明杰,赵迪,李龙宇,等.水蛭素的药理作用及临床应用研究进展[J].中国现代中药,2021,23(4):747-754.

[12]翁成杰,王玉萍,施若霖,等.创伤弧菌脓毒症患者的预后影响因素分析[J].中华急诊医学杂志,2021,30(5):612-616.

[13]李红梅,王显.紫杉醇水蛭素支架涂层复合物对LPS诱导的HCASMC炎性活化过程中核转录因子NF-κB p65及其下游炎症因子的调控作用[J].中国循证心血管医学杂志,2018,10(2):203-206.

基金资助:江西省卫生健康委员会科技计划【No.202311316,202311317】;

文章来源:龚海林,陈明,张念清.水蛭素对脓毒症大鼠血小板功能的影响[J].中国中医药现代远程教育,2024,22(16):135-137.