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松三糖对溃疡性结肠炎的作用

2024-07-19 8 上传者：管理员

摘要：目的通过葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导建立溃疡性结肠炎（UC）小鼠模型，探讨松三糖（MELE）对UC小鼠的作用机制。方法将48只SPF级雄性c57BL/6小鼠随机分为正常组（0.9%NaCl）、模型组（0.9%NaCl）、对照组(100 mg·kg-1美拉沙秦)和低、中、高剂量实验组(20、40、80 mg·kg-1松三糖溶液)。通过给予3%DSS溶液代替饮用水诱导UC模型，并进行疾病活动指数（DAI）评估。用酶联免疫吸附试验法检测血清中白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-6、IL-10和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平，用蛋白质印迹法检测主要组织相容性复合体Ⅱ（MHCⅡ）和表面抗原分化簇4受体（CD4）蛋白的表达水平。结果中、高剂量实验组和模型组、正常组的血清中IL-1β水平分别为（82.15±13.66）、（75.56±11.07）、（118.20±19.31）和（23.47±4.72）pg·mL-1,IL-6水平分别为（71.54±16.48）、（58.57±15.62）、（140.60±5.76）和（30.33±4.15）pg·mL-1,IL-10水平分别为（48.64±5.60）、（52.65±7.99）、（27.10±4.91）和（61.90±10.44）pg·mL-1,TNF-α水平分别为（70.33±8.51）、（66.55±8.12）、（90.88±4.90）和（34.18±4.15） pg·mL-1,MHCⅡ蛋白相对表达水平分别为0.34±0.04、0.15±0.06、0.08±0.05和0.53±0.59,CD4蛋白相对表达水平分别为0.79±0.08、0.92±0.12、0.99±0.11和0.54±0.14。中、高剂量实验组和正常组的上述指标与模型组比较，在统计学上差异均有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。结论松三糖能够有效改善UC小鼠的症状，其作用机制可能是通过下调MHCⅡ蛋白和上调CD4蛋白表达来激活T细胞信号通路，从而发挥抗炎作用。

关键词：
UC
刺糖
抗炎
松三糖
溃疡性结肠炎
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溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是常见的一种炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)[1]。2023年全球UC的患病率预计为500万例，全球发病率正不断上升，具有年轻化的趋势[2]。因此，寻找低毒且高效的天然药物已成为近年来的研究热点。近年来，功能性低聚糖已广泛用于食品、保健、医药等领域中，现代研究表明，功能性低聚糖具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化以及免疫调节等活性[3,4,5]。刺糖是豆科植物骆驼刺属骆驼刺Alhagi pseudoalhagi Desv.的分泌糖粒，含有丰富的天然多糖和低聚糖。本课题组从刺糖中分离得到一种低聚糖，经结构鉴定为松三糖(melezitose),是一种功能性非还原三糖。本研究通过构建UC模型，用蛋白质印迹法探讨松三糖对UC的作用机制，为进一步开发天然免疫功能性产品提供实验支持和理论基础。

一、材料与方法

1 材料

动物SPF级雄性C57BL小鼠，鼠龄6周，体质量(20±2)g, 购自新疆医科大学动物实验中心。动物生产许可证号：SCXK(新)2018-0002,动物使用许可证号：SYXK(新)2018-0003。本实验经新疆医科大学动物伦理委员会批准(伦理批号：IACUC-20210507-3)。

药物及试剂刺糖，批号：Z3006740,产地：新疆，购自新疆麦迪森药业有限公司，经新疆医科大学单位胡君萍教授鉴定为刺糖药材；美拉沙秦肠溶片，规格：每片0.25 g, 批号：20220502,批准文号：国药准字H20103359,购自黑龙江天宏药业股份有限公司。葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate, DSS),购自美国MP Biomedicals公司；白细胞介素(interleukin, IL)-1β、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测试剂盒，均购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司；主要组织相容性复合体 Ⅱ(major histocompatibility complex Ⅱ,MHC Ⅱ)和表面抗原分化簇4受体(cluster of differentiation 4 receptors, CD4)抗体，均购自英国Abcam公司。

仪器DYY-6C电泳仪、680酶标仪，均为美国Bio-Rad公司产品。

2 实验方法

2.1 松三糖的制备[6]6]

将刺糖药材按照料液比1∶3的比例加入石油醚中，浸泡24 h, 得到脱脂后的刺糖药材，将脱脂后的刺糖药材按照料液比1∶14的比例加入水中进行提取，提取时间为2 h, 提取温度为70 ℃,提取2次，过滤药渣，合并提取液，浓缩，用80%乙醇进行醇沉；在4 ℃条件下静置24 h, 收集上清液。将上清液于4 ℃下继续静置7 d, 得到结晶产物，对结晶产物进行脱色、重结晶，得白色结晶颗粒，得率为13.65%。经红外光谱、核磁共振、质谱等分析手段结构表征该低聚糖为松三糖，纯度为99.85%。

2.2 模型构建、动物分组与给药方法[7,8,9]7-9]

将C57BL/6小鼠随机分为正常组、模型组、对照组和低、中、高剂量实验组，每组8只。实验开始造模前7 d, 正常组、模型组和对照组均灌胃给予0.9%NaCl 0.20 mL,低、中、高剂量实验组分别灌胃给予20、40、80 mg·kg-1松三糖溶液0.20 mL;第8天起除正常组外，其余各组均给予3%DSS溶液代替饮用水7 d, 同时，低、中、高剂量实验组继续给药，对照组灌胃给予100 mg·kg-1美拉沙秦，正常组和模型组均灌胃给予0.9%NaCl 0.20 mL。

2.3 样本采集

实验第15天麻醉进行眼球取血，收集小鼠粪便和肠道内容物，取小鼠结肠组织，测定其长度；取结肠0.50 cm置于4%多聚甲醛溶液用于病理切片。余下组织置于-80 ℃留存，备用。

2.4 疾病活动指数(disease activity index, DAI)评价

从宏观角度评价UC小鼠的状态，通过对小鼠体质量、粪便松软度、便血程度这3个方面进行考察小鼠结溃疡性肠炎症状程度，评分表参考相关研究[10]制定。0分：体质量下降率<1%、大便正常、无便血；1分：1%<体质量下降率<5%、大便正常、无便血；2分：6%<体质量下降率<10%、稀便、轻微出血；3分：11%<体质量下降率<15%、稀便、轻微出血；4分：体质量下降率>15%、水样腹泻、严重出血。

2.5 ELISA法检测血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10含量[11]11]

小鼠血液在4 ℃下，以3 500 r·min-1离心10 min, 取上清液，用ELISA法检测小鼠血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10含量。

2.6 蛋白质印迹法检测MHC Ⅱ和CD4蛋白的表达水平[12]12]

用RIPA裂解液提取蛋白后，用BCA试剂盒检测浓度。定量上样，将样品电泳至分离胶底部，转膜后用5%脱脂奶粉溶液室温封闭2 h, 洗膜3次，每次10 min; 4 ℃环境孵育一抗过夜，洗膜，每次10 min, 共3次；室温孵育二抗1 h后洗膜，每次10 min, 共计3次；按照1∶1配制显影剂，经曝光显影后，用Image J软件处理条带，并计算目的蛋白条带与β-actin条带灰度值的比值。

2.7 结肠组织病理学观察[13]13]

用4%多聚甲醛进行小鼠结肠组织的固定，纯化水清洗1 h, 用梯度浓度的乙醇进行脱水处理，再将结肠组织用二甲苯处理，对结肠组织进行包埋，制成厚度为5 μm切片，经苏木精-伊红染色后，在光学显微镜下观察结肠组织病理变化。

3 统计学处理

用SPSS 25.0软件进行统计分析，用GraphPad Prism 8.0作图。实验数据用

表示，组间比较用单因素方差分析。

二、结果

1 松三糖对DSS诱导的UC小鼠体质量、DAI评分及结肠长度的影响

低、中、高剂量实验组分别给予20、40、80 mg·kg-1松三糖溶液；对照组给予100 mg·kg-1美拉沙秦；正常组和模型组均给予等量0.9%NaCl。

模型组、对照组和低、中、高剂量实验组的体质量和结肠长度均较正常组有所下降，DAI评分均较正常组有所升高；中、高剂量实验组和对照组均较模型组显著缓解了小鼠体质量的降低，显著降低DAI评分，显著增加结肠长度(P<0.01,P<0.05)。结果见表1。

2 松三糖对DSS诱导的UC小血清中炎性因子水平的影响

模型组与正常组比较，血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均显著升高，IL-10水平显著降低(均P<0.01)。中、高剂量实验组和对照组血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均较模型组显著降低(P<0.05,P<0.01),低、中、高剂量实验组和对照组血清中IL-10水平均较模型组显著升高(P<0.05,P<0.01)。结果见表2。

3 松三糖对DSS诱导的UC小鼠结肠组织中MHC Ⅱ和CD4蛋白表达的影响

低、中、高剂量实验组和正常组、模型组的MHC Ⅱ蛋白相对表达水平分别为0.44±0.34、0.34±0.04、0.15±0.06、0.08±0.05和0.53±0.59,CD4蛋白相对表达水平分别为0.57±0.14、0.79±0.08、0.92±0.12、0.99±0.11和0.54±0.14。模型组与正常组比较，MHC Ⅱ蛋白相对表达水平显著升高，CD4蛋白相对表达水平显著下降(均P<0.01);中、高剂量实验组与模型组相比，MHC Ⅱ蛋白相对表达水平均显著下降(均P<0.01),CD4蛋白相对表达水平均显著升高(均P<0.01)。结果见图1。

表1 6组小鼠体质量变化率、疾病活动指数和结肠长度的比较

表2 6组小鼠血清中白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-10和肿瘤坏死因子(TNF)-α水平的比较

4 松三糖对DSS诱导的UC小鼠结肠组织病理形态的影响

正常组小鼠的结肠组织结构正常，结肠细胞形态大小正常；模型组与正常组比较，小鼠的结肠组织可见明显的隐窝破坏或消失，炎性细胞浸润增加，可见的结肠黏膜组织损伤；中、高剂量实验组与模型组比较，小鼠的结肠组织结构改善，炎性细胞浸润减少，肠组织病理损伤明显减轻。这表明松三糖能够有效改善DSS诱导的UC小鼠结肠组织的病理损伤。结果见图2。

图1 用蛋白质印迹法检测5组小鼠结肠组织中主要组织相容性复合体Ⅱ(MHC Ⅱ)和表面抗原分化簇4受体(CD4)蛋白的表达情况

图2 6组小鼠结肠组织病理形态的变化(苏木精-伊红染色，×100)

三、讨论

UC是一种局限于结肠黏膜和黏膜下层的疾病，发病过程中可在不同程度上影响直肠和结肠，具有反复发作的特点。目前，UC的临床治疗手段主要通过抗炎药物、免疫抑制药等[14],但这些药物也显示出其局限性，如治疗成本昂贵，长期使用也会导致严重的药物不良反应，这都将持续影响患者的生活质量[15]。因此，对来自天然和功能性食品的替代候选资源的需求不断增加。本研究用水提醇沉法得到松三糖，该法操作较简单，收率较高，且纯度较高，适用于大批量获取，提高提取效率，同时，该法也为对松三糖的开发利用提供技术支持。在松三糖生物活性功能探究中，本研究通过DSS诱导建立UC模型，并给予松三糖，结果发现，松三糖能够显著改善结肠的炎症，缓解小鼠体质量减轻，显著缓解了因炎症导致的结肠长度的缩短，显著降低了小鼠血清中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平，并升高了抑炎因子IL-10的水平，这些炎症因子与肠道炎症息息相关。研究表明，DSS会对结肠上皮细胞造成损伤，使结肠紧密连接和基底膜受到破坏，导致肠道渗透性增加[16,17]。此时，肠道受到致病菌长期过度侵袭，致病菌抗原进入体循环中，导致更为严重的全身性的免疫反应，进而使血清中IL-1β、IL-6和TNF-α等细胞炎症因子含量急剧上升。经松三糖干预后，UC小鼠血清中炎症因子水平整体下降，抑炎因子IL-10含量显著升高，结肠炎症得到明显的改善，提示松三糖可能通过调节肠道炎症因子水平来改善炎症反应。

MHC Ⅱ蛋白的功能主要是在免疫应答的开始阶段将经过处理的抗原片段递呈给CD4 T细胞，主要参与外源性抗原的递呈，在免疫应答中，Ⅱ类抗原主要是协调免疫细胞间的相互作用，调控体液免疫和细胞免疫应答。CD4主要表达于辅助T细胞(helper T,Th)细胞，是Th细胞TCR识别抗原的供受体，与MHC Ⅱ类分子的非多肽区结合，参与Th细胞TCR识别抗原的信号传导。这2个蛋白对抗原免疫应答起着关键性作用，本实验通过蛋白质印迹法检测结肠组织中MHC Ⅱ和CD4蛋白的表达水平，结果发现，模型组的MHC Ⅱ蛋白表达水平明显升高、CD4蛋白表达水平明显下降，给予松三糖后，MHC Ⅱ蛋白表达水平明显下降、CD4蛋白表达水平明显升高，提示松三糖通过T细胞免疫相关通路改善结肠炎。

本研究提示：松三糖能够有效改善UC小鼠的症状，调节炎症因子水平，其抗炎的机制可能是降低MHC Ⅱ蛋白表达和升高CD4蛋白表达，激活T细胞免疫的应答，发挥免疫调节作用。本研究为松三糖的免疫活性研究提供了资料，为松三糖在食品添加剂、天然免疫活性制品开发利用提供实验基础。

参考文献:

[6]陈盈盈,李杰,宋建忠,等.刺糖多糖脱色脱蛋白工艺及抗氧化活性研究[J].化学试剂,2023,45(1):46-53.

[7]李杰,陈盈盈,王昆,等.基于TLR4/MyD88信号通路探讨刺糖多糖对溃疡性结肠炎小鼠的作用及机制[J].中药新药与临床药理,2022,33(9):1143—1148.

[8]李阳,郝艺照,傅熠俊,等.黄连素预防葡聚糖硫酸钠诱导溃疡性结肠炎的作用机制[J].中华中医药杂志,2017,32(8):3431—3435.

[12]卢立伟,王孟兰,周晓君,等.异甘草素对湿热哮喘模型大鼠气道炎症的作用及机制[J].中国临床药理学杂志,2023,39(24):3628—3632.

基金资助:国家自然科学基金资助项目(82060756); 新疆维吾尔自治区重大科技专项基金资助项目(2022A03019-3);

文章来源:陈章浩,高霜,李进发,等.松三糖对溃疡性结肠炎的作用[J].中国临床药理学杂志,2024,40(14):2083-2087.