氧化应激是生物体氧化还原失衡的一种状态，由于生物体受到刺激时产生过量的活性氮（RNS）或者活性氧簇（ROS），可导致动态平衡被受到破坏[1]。炎症是机体对感染和组织损伤的适应性反应[2]，在炎症过程中有多种类型的细胞介质被释放和激活，包括趋化因子、细胞因子、血管活性胺和黏附分子[3]。越来越多的证据表明氧化应激和炎症之间存在相互联系，ROS/RNS过量产生会压倒抗氧化防御系统，导致氧化/亚硝化应激，破坏细胞结构和信号通路，最终引发疾病和衰老[4]。维持氧化还原平衡的相关机制对氧化应激疾病的治疗至关重要，因此越来越多的学者在积极寻找具有明显抗氧化作用的天然药物。

海蓬子（Salicornia europaeaL.）又称海芦笋、盐葫芦，属于藜科、盐角草属的无叶茎肉质化的双子叶草本植物[5]，在盐碱环境中成长，分布于我国辽宁、山东、江苏等地区，一般生长于含盐量较高的海岸、盐沼地及盐湖旁。《中华本草》记载海蓬子有平肝、利尿、降血脂的功效，主治高血压和头痛等疾病[6]。目前，已从海蓬子中分离得到黄酮、萜类、多糖、甾醇和生物碱等多种活性成分，具有抗氧化、抗癌、抑菌及抗炎等药理活性，对于肿瘤、糖尿病、肝炎等多种疾病具有预防和治疗的作用[7,8]。网络药理是一门新兴学科，将网络生物学和药理学结合起来，通过构建“药物、靶标、疾病、信号通路”之间相互关联的网络，来预测和分析药物的作用机制。本研究基于中药通过多组分、多靶点发挥作用的研究思路，拟采用网络药理及实验验证相结合的研究方法，从海蓬子的化学成分、作用靶点和相关疾病入手，阐明其抗氧化和抗炎的作用机制，为今后应用于预防和治疗相关疾病提供理论依据。

1、材料与方法

1.1 代表性活性成分的检索、筛选

以“海蓬子”为关键词在有机小分子生物活性数据库（PubChem）、中医药综合数据库（TCMID）、医学文献检索服务系统（PubMed）、中国知网（CNKI）等数据库进行检索，筛选得到活性成分，再通过Swiss Target Prediction数据库预测药物成分的相关靶点。在此基础上，对收集到成分的基因靶标进行筛选，并通过Uniprot(https：//www.uniprot.org/）对其进行规范矫正。

1.2 疾病靶点筛选

将“antiinflammation”和“antioxidant”作为关键词在GeneCards数据库、Drugbank和Online MendelianInheritanceinMan(OMIM）数据库中进行检索，查找与抗炎、抗氧化相关的潜在疾病靶点取交集。在此数据库中，具有高相关性分数的基因被认为是该疾病的靶标，因此选定Score>1分的目标靶点为潜在作用靶点。

1.3“疾病-植物-活性成分-作用靶点-信号通路”网络图的构建

将疾病相关靶点与药物活性成分整理至Excel文档中，通过Venn在线平台得到的重叠靶点绘制韦恩图，重叠部分即为海蓬子抗氧化、抗炎的关键靶点，所有数据均在Cytoscape3.9.1进行分析和可视化。

1.4 蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络建立与分析

通过Venn在线平台得到重叠靶点，将数据发送到在线平台STRING，“人类”作为限定物种，以获得潜在靶点蛋白的交互作用。随即进入在线软件Cytoscape3.9.1并使用软件插件“Cytonca”计算Closeness、Betweenness和Degree，根据Degree对靶点进行筛选，得到关键靶点，进行可视化分析。

1.5 GO功能富集分析及KEGG信号通路注释分析

为研究潜在靶点在抗炎、抗氧化治疗作用中的生物学功能，通过DAVID平台对重叠靶点进行分析，以P为标准从高至低排序，使用在线分析工具微生信对前10位进行可视化展示。GO分析涵盖了生物过程（BP）、细胞组分（CC）以及分子功能（MF）的方面，KEGG通路分析有助于识别参与生物过程的重要信号通路。

1.6 动物实验验证

1.6.1 材料与设备

海蓬子提取物（SE，实验室自制，取新鲜海蓬子于日光下暴晒并剪成长约1 cm的碎渣，晾干。取海蓬子干品研磨过80目筛，在45℃下用6倍量的石油醚回流至无色，过滤后取滤渣于通风橱晾干后，放入55℃烘箱中至完全干燥，即得干燥脱脂的SE），维生素C片（天津力生制药有限公司），丙二醛（MDA）含量检测试剂盒（南京建成科技有限公司），蛋白质羰基含量检测试剂盒（南京建成科技有限公司），还原性谷胱甘肽（GSH）含量检测试剂盒（南京建成科技有限公司），电子天平（赛多利斯），高速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司），U-3900紫外分光光度计（日本日立）。

1.6.2 实验动物

SPF级雄性昆明种小鼠60只，初体重18～20 g，周龄为4周，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证编号：SCXK（京）2014-0004，批号：110324231105324486。正式饲养前，小鼠适应饲养7 d，室温（22±2）℃，相对湿度60%～70%，给予12 h正常光照，自由饮食、摄水。

1.6.3 氧化损伤小鼠模型建立方法[9,10]

将适应后的小鼠按简单随机分组法分为6组：空白组，高、中、低SE剂量组，维生素C对照药组，模型组，每组10只。按照表1的给药剂量给药，持续灌胃30 d。于第30天给药后，对小鼠均禁食16 h（空白组除外），再一次性灌胃体积分数为50%的乙醇溶液（每只小鼠按12 m L/kg),6h后取材，对血清和肝脏组织中脂质氧化产物的含量、蛋白质羰基的含量、GSH的含量进行测定，其相关含量值用来评价氧化损伤的能力[11]。

表1 动物分组及给药方案 

1.6.4 组织样品取材

采用眼眦取血，后将小鼠断颈处死，采用无菌器械解剖小鼠，获得肝脏组织。

1.6.5 组织样品制备

所得血样放置30 min后，于离心机中，以2000r/min离心10min，取上清，备用。将“1.6.4”中所得肝脏，加入生理盐水（1 9），于离心机中，以2 000 r/min，离心10 min，取上清，备用。以不同试剂盒使用说明书为依据，分别测定小鼠血清和肝脏组织中的MDA、蛋白质羰基、GSH含量。

1.7 统计学处理

采用IBM SPSS27.0软件进行统计，符合正态分布的数据使用±s表示，运用单因素方差分析进行各组间比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 中药的活性成分及靶点

通过多个数据库的检索整合，如表2所示，最终得到海蓬子活性成分20个和相应靶点707个；利用Swiss Target Prediction网站进行靶点预测整合，删去重复值之后，共获得308个总靶点。

2.2 疾病相关靶点筛选及共同靶点预测

经过GeneCards等数据库的分析及筛选，共获得抗炎疾病靶点1 868个，抗氧化疾病靶点1 222个。将2.1项下的308个成分靶点与疾病靶点导入在线软件Venny2.1.0绘制韦恩图取交集（图1），得到207个药物活性成分与疾病的交集靶点，即为海蓬子抗炎、抗氧化作用的潜在靶点，其中92个靶点为海蓬子与抗炎和抗氧化三者共同靶点。

2.3“疾病-植物-活性成分-靶点-作用通路”网络

构建的网络图清晰地表明，海蓬子通过多种成分、靶点和信号通路发挥着抗氧化、抗炎的作用，活性成分根据基因度值（Degree）由高至低排序（图2）。  

表2 海蓬子主要活性成分信息

图1 药物成分基因和抗氧化、抗炎的潜在靶点

图2 海蓬子“疾病-植物-活性成分-靶点-作用通路”网络图   

2.4 PPI网络构建及潜在靶点筛选

将上述的207个交集靶点导入至在线数据平台STRING进行进一步分析，得到PPI网络图（图3），该图包含13个节点和49条边。一个节点对整个网络的贡献程度可以通过一个连接数来确定，称为度，度值越大，对差异表达基因集的调控作用越强。图中基因度值（Degree）排名靠前的分别为DRD2、HTR1A、SLC6A3、胆碱能受体（CHRNA4）、去甲肾上腺素转运受体（SLC6A2）、5-羟色胺受体2C(HTR2C）等，上述靶点可能为海蓬子抗氧化、抗炎的潜在靶点。

图3 交集靶点PPI网络图   下载原图

Fig.3 PPI network diagram of intersection targets

2.5 GO富集分析

为了进一步研究海蓬子抗氧化、抗炎的作用机制，将207个交集靶点导入数据平台DAVID，进行富集分析。共富集到989个相关条目，其中主要包含BP：信号转导RNA、聚合酶Ⅱ启动子的转录正调控、凋亡过程负向调控；CC：胞质、等离子体膜、核；MF：蛋白结合、相同的蛋白质结合、ATP结合（图4）。

图4 GO-BP、GO-CC、GO-MF分析结果条形图   下载原图

Fig.4 Bar graphs of GO-BP,GO-CC,GO-MF analysis results

2.6 KEGG分析

对207个抗氧化、抗炎的交集靶点进行KEGG信号通路分析（图5）。结果表明，海蓬子抗氧化、抗炎作用主要涉及信号通路包括：癌症中的蛋白聚糖、脂质和动脉粥样硬化、化学致癌-活性氧、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt）等。

图5 KEGG富集分析通路

2.7 小鼠体重测定

造模开始时各组小鼠体重无明显差异，于给药14 d后，SE各剂量组较模型组体重显著降低（均P<0.01）。在第21天后，与模型组比较，各组小鼠体重相差不大，均无显著性差异（表3）。

2.8 MDA含量测定

如表4所示，与空白组相比，模型组小鼠血清中MDA含量显著升高（P<0.01），表明小鼠氧化损伤造模成功。此外，与模型组相比，各给药组的MDA含量值显著降低（均P<0.001）。2.9小鼠肝脏中蛋白质羰基及GSH含量测定结果如表5所示，与模型组相比，各给药组肝脏中蛋白质羰基含量均降低（均P<0.001）。与模型组相比，高、中、低SE剂量组肝脏中GSH含量均较高，且中剂量组GSH含量显著升高（P<0.001）。 

表3 海蓬子植物盐对小鼠体重的影响（g,±s,n=10)  

表4 各组小鼠血清中MDA含量（±s,n=10)  

表5 各组小鼠肝脏中蛋白质羰基含量和GSH含量（±s,n=10)  

3、讨论

本文通过网络药理学方法，以海蓬子为研究对象，筛选出了其具有抗氧化、抗炎的活性成分及对应靶点，通过分析生物网络图发现，海蓬子共有20个活性成分与抗炎和抗氧化作用有关，其中重要活性成分为：十五烷基阿魏酸、麦角甾醇、刺五加苷B等。研究发现，从海蓬子乙酸乙酯提取的天然产物十五烷基阿魏酸具有抗氧化和抗肿瘤活性[12]。Karthivashan等[13]从海蓬子乙醇提取物中分离得到了刺五加苷B，通过东莨菪碱诱导的小鼠遗忘模型，证实了刺五加苷B具有抗氧化、抗炎和抗遗忘等作用。麦角甾醇是类异戊二烯化合物家族的一部分，已被证实具有抗炎、抗癌、免疫调节、抗氧化、神经保护等作用，是一种天然抗氧化剂[14]。

通过构建海蓬子抗氧化和抗炎的相关靶点PPI网络并对其进行拓扑分析表明，DRD2、HTR1A、SALC6A3、CHRNA4、SLC6A2等为抗氧化和抗炎的关键靶点。DRD2为基因DopamineReceptorD2的简称，它是一种多巴胺受体，位于大脑内的蛋白质，其在机体内起到重要作用，并通过多种信号传递系统影响脑神经细胞中内源性激素的数量和比例。它在大脑的行为控制中起着关键作用，比如视觉、情绪和记忆、睡眠和愉悦等。大多数神经药物反应都集中在多巴胺能通路上，这是精神类疾病药物的主要功能机制之一，特别是DRD2基因[15]。5-羟色胺（5-HT）是一类主要分布于大脑皮质和突触中的神经递质，它的缺乏会导致多种情绪症状，如焦虑、抑郁、注意力不集中等。5-HT受体亚型家族较广，其中HTR1A受体激动剂具有抗焦虑作用[16]。HTR1A与5-HT功能失调有非常紧密的联系，其在大脑皮层和海马及下丘脑等脑区分布较广[17]。激活HTR1A表达会抑制动物焦虑行为且HTR1A激活会减少细胞外调节蛋白激酶磷酸化。有研究证明，HTR1A基因与多种精神疾病密切相关，HTR1A受体是5-羟色胺能抗抑郁药物的关键靶点[16]。SLC6A2、SLC6A3均为涉及多巴胺通路和去甲肾上腺素通路的基因，研究发现SLC6A3突变与多种疾病有关，基因在突触间多巴胺浓度调节中发挥重要作用，影响帕金森患者的左旋多巴治疗反应[18]。CHRNA4编码的神经元烟碱乙酰胆碱受体（n AChR）的亚基之一，是一种重要的信号传递分子，在神经系统中发挥着重要作用[19]。

KEGG通路富集分析结果表明，海篷子主要通过脂质和动脉粥样硬化、化学致癌-ROS、PI3K-Akt等信号通路发挥抗氧化和抗炎的作用。动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，其适应性免疫系统可以促炎或抗炎，从而促进或抵抗动脉粥样硬化，ROS的产生能够加速动脉粥样硬化。ROS/RNS的过量产生会改变细胞的正常功能，引起组织损伤，进而促进多种疾病的发生和进展，包括癌症、阿尔茨海默病和糖尿病等许多慢性疾病[20,21]。前期本实验室已经证明，SE能纠正糖尿病造成的脂代谢紊乱，具有一定的抗过氧化作用[22]。氧化应激是动脉粥样硬化的主要致病因素之一[23,24]，氧化应激会造成体内细胞受损，进而诱发人体出现炎症。研究者发现，过氧化脂质可以诱导RPE细胞炎症发生[25]。细胞内重要的信号通路之一是PI3K/Akt信号通路，它可以调节细胞生长、分化和凋亡以及代谢的过程，是调节炎症因子产生的经典信号通路。有研究证实，PI3K/Akt信号通路的激活具有诱导小胶质细胞M2表型、减轻炎症与保护神经的作用[26]。以上研究表明，减少脂质和动脉粥样硬化对抗氧化有一定的作用，调控PI3K/Akt信号通路可能成为抗炎和抗氧化疾病的关键机制，抗氧化和抗炎作用之间存在相关性。

氧化损伤模型有多种，其中乙醇诱导的氧化损伤动物模型具有实验周期短、毒性低等优势[27]。本研究中选用GSH、MDA等作为抗氧化的评价指标，GSH主要来源为肝细胞，可通过促进GSH的表达识别过氧化损伤；MDA是一种醛类的反应产物，过量可损伤细胞结构导致疾病的发生。实验结果表明SE可使MDA、蛋白质羰基含量降低，GSH含量升高，说明SE具有明显的抗氧化作用。

综上，本研究通过构建“疾病-植物-成分-作用靶点-信号通路”网络图、交集靶点PPI图等，从多方面分析了海蓬子的抗氧化及抗炎的作用机制，并通过实验验证了其抗氧化作用，研究结果将为海蓬子发挥抗氧化和抗炎作用用于相关疾病的治疗提供理论基础。

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文章来源:毕凤荷,王冉冉,乔卫.基于网络药理学和实验验证探讨海蓬子抗氧化和抗炎的作用机制[J].天津医科大学学报,2024,30(04):332-337.