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摘要:目的 研究含羞草根乙酸乙酯部位(简称为乙酸乙酯部位)对急性髓系白血病小鼠的影响。方法 以不同质量浓度(0.062 5、0.125、0.25、0.5 mg/mL)乙酸乙酯部位作用于急性粒-单核细胞白血病细胞WEHI-3,考察其对该细胞活力的影响。将50只BALB/C小鼠随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组(5-氟尿嘧啶,13 mg/kg)和乙酸乙酯部位低、高剂量组(50、200 mg/kg),每组10只。除空白对照组外,其余各组小鼠均腹腔注射WEHI-3细胞悬液进行造模,并在造模第2天起灌胃相应药物/水,每天1次,连续14 d。末次给药后,检测小鼠肝、脾指数,并进行肝组织病理学形态观察和血液学分析以及白细胞分化检测;检测小鼠血清中细胞因子[白细胞介素2(IL-2)、IL-3、干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)]水平;检测小鼠全血中白细胞表面标志物[分化簇3(CD3)、CD19、CD11b、分化簇107b(即Mac-3)]抗体水平。结果 经0.062 5~0.5 mg/mL的乙酸乙酯部位作用后,WEHI-3细胞增殖抑制率均显著升高(P<0.05)。经高剂量的乙酸乙酯部位干预后,小鼠的肝、脾指数,血清中TNF-α水平,全血中白细胞表面CD11b、Mac-3抗体水平均显著降低(P<0.05),血清中IL-2、IL-3、IFN-γ水平和全血中白细胞表面CD3、CD19抗体水平均显著升高(P<0.05);肝实质偶有淋巴细胞浸润,几乎无炎症细胞浸润;血液学指标改善且白细胞分化减弱。结论 含羞草根乙酸乙酯部位可抑制WEHI-3细胞增殖,改善急性髓系白血病小鼠症状,其作用机制与增强机体免疫功能有关。
白血病是一类以异常造血细胞恶性增殖、分化受阻、凋亡受抑并造成正常血细胞减少为特征的疾病,发病率在肿瘤疾病中居第6位[1]。其中,急性粒-单核细胞白血病是由粒细胞和单核细胞系同时发生恶性增生所导致的急性白血病,其发病人数约占急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)发病人数的15%[2]。该病发病诱因多而复杂,且目前的治疗药物价格昂贵、副作用大,治疗预后不佳[3]。
含羞草根为豆科植物含羞草Mimosa pudica Linn.的根,主要含有黄酮类、生物碱类成分,具有抗肿瘤、保肝、抗菌等药理作用[4]。相关研究发现,含羞草根提取物及其不同组分对小鼠腹水癌细胞S180、人结肠癌细胞HCT-116、人卵巢癌腺癌细胞OVCAR-8、人XG恶性胶质瘤细胞SF-295均有不同程度的促凋亡作用[4,5]。本课题组前期对含羞草根提取物的不同组分进行体外抗肿瘤活性筛选后发现,含羞草根乙酸乙酯部位(以下简称“乙酸乙酯部位”)的抗肿瘤效果较优。基于此,本研究首先以小鼠急性粒-单核细胞白血病细胞WEHI-3为研究对象,从体外角度考察乙酸乙酯部位对该细胞增殖的影响;再以WEHI-3细胞构建小鼠AML模型,从体内角度考察乙酸乙酯部位对AML动物模型的影响及机制,以期为含羞草根在白血病治疗领域中的应用提供理论及实验参考。
1、材料
1.1 主要仪器
本实验所用主要仪器包括N-4000W型旋转蒸发仪、FDU-2110型真空冷冻干燥机(东京理化器械株式会社),INC015型CO2恒温细胞培养箱(德国Memmert公司),Epoch2型全波长酶标仪(美国Bio-Tek公司),KA-100型低速离心机(上海安亭科学仪器有限公司),Cyto‐FLEX型流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司),IX73型倒置显微镜(日本Olympus公司),DYY-6C型恒压电泳仪(北京六一生物科技有限公司),Chem Studio PLUS型超敏多功能成像仪(德国AJ公司)。
1.2 主要药品与试剂
含羞草根购自四川瑞芝堂生物科技有限公司,经广东药科大学中药学院中药资源教研室刘基柱副教授鉴定为豆科植物含羞草M.pudica Linn.的根。RPMI1640培养基、胎牛血清(批号分别为11875093、10099141C)均购自美国Gibco公司;青霉素/链霉素溶液、0.25%胰蛋白酶消化液、磷酸盐缓冲液(PBS)、CCK-8试剂(批号分别为PWL062、PWL060、MA0015、MA0218)均购自大连美仑生物技术有限公司;鼠源分化簇3(cluster of differen‐tiation 3,CD3)抗体、鼠源CD19抗体、鼠源CD11b抗体(批号分别为E-AB-F1013D、E-AB-F0986D、E-AB-F1081C)均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司;鼠源CD107b(即Mac-3)抗体(批号108501)购自美国Bio Legend公司;小鼠白细胞介素2(interleukin-2,IL-2)、IL-3、干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(批号分别为RX203061M、RX203056M、RXSWXQ203097M、RXSWSXQ202412M)均购自广州市睿信生物科技有限公司;5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)(批号MB1273-S)购自大连美仑生物技术有限公司。
1.3 实验动物
本研究所用动物为SPF级雄性BALB/C小鼠,6~8周龄,体质量19~22 g,购自广东省实验动物中心,动物生产许可证号为SCXK(粤)2022-0002。实验前,小鼠适应环境1周,然后置于饲养笼中,在12 h光照循环下,自由摄食饮水。所有涉及动物的实验程序均经广东省医学实验动物中心实验动物伦理委员会批准(伦理编号为D202404-5)。
1.4 细胞
小鼠急性粒-单核细胞白血病细胞WEHI-3(货号CTCC-003-0222)购于浙江美森细胞科技公司。细胞用含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素双抗的RPMI1640培养基,于37℃、5%CO2无菌恒温培养箱中培养,隔天传代1次备用。
2、方法
2.1 含羞草根提取物的制备
取干燥的含羞草根3 kg,除去杂质,洗净,使用中药粉碎机粉碎;以80%乙醇(料液比为1∶10,kg/L)连续加热提取2 h×3次,收集并合并提取液;将提取液置于旋转蒸发仪中干燥,得浸膏后以纯净水复溶,再以乙酸乙酯萃取;将萃取部分置于冷冻干燥机中干燥,得乙酸乙酯部位20.96 g,备用。
2.2 细胞增殖活力测定
将处于对数生长期的WEHI-3细胞以2×104个/孔接种于96孔板中,于37℃、5%CO2条件下培养24 h后,使用不同质量浓度(0.062 5、0.125、0.25、0.5 mg/m L,给药浓度根据前期预实验结果设置)的乙酸乙酯部位(另设置不加药物只加细胞的空白组)处理细胞24、48、72h,每个时间点各组均设置7个复孔。培养结束后,每孔加入含10%CCK-8的培养基共同孵育75 min,然后采用酶标仪于450 nm波长处测定吸光度值,并计算细胞增殖抑制率,具体公式为细胞增殖抑制率(%)=(空白组吸光度-药物组吸光度)/空白组吸光度×100%。实验重复3次。
2.3 动物分组、造模、给药与一般情况观察
将小鼠随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组(5-FU,13 mg/kg)和乙酸乙酯部位低、高剂量组(50、200mg/kg),每组10只,剂量依据参考文献[6]设置。除空白对照组外,其余各组小鼠均腹腔注射WEHI-3细胞悬液0.1 m L(细胞密度为8×105个/m L)进行造模;从第2天起,给药组小鼠灌胃相应药物(0.1 m L/g,临用时以纯净水溶解),空白对照组和模型组小鼠灌胃等体积水,每天1次,连续14 d。造模7 d后,随机取造模小鼠6只,眼眶取血100μL进行血液学检测,若白细胞计数大于10×103μL-1,则表明AML模型造模成功。给药期间每天观察各组小鼠精神状态、腹部形态、运动状态及进食量等的变化,并每天记录小鼠体重。
2.4 小鼠肝、脾指数检测及肝组织病理学形态观察
末次给药1 h后,对各组小鼠眼球取血适量,一部分置于抗凝管中保存备用;另一部分置于1.5 m L离心管中,静置30 min,离心取上层血清备用。麻醉小鼠后剖取其肝脏和脾脏组织,称质量,并计算肝、脾指数[肝(脾)指数=肝(脾)组织质量/体重];将肝组织用多聚甲醛固定,经石蜡包埋、切片后进行苏木素-伊红(HE)染色,采用显微镜观察肝组织病理学变化。
2.5 小鼠血液学分析及白细胞分化检测
取“2.4”项下抗凝管中保存的全血样品适量,采用血常规检测仪进行血液学分析(具体指标有白细胞计数、血红蛋白水平、红细胞比容、平均红细胞体积、红细胞平均血红蛋白量、红细胞平均血红蛋白浓度)及白细胞分化检测(具体指标有淋巴细胞计数、中性粒细胞计数、单核细胞计数、嗜酸性粒细胞计数、嗜碱性粒细胞计数)。
2.6 小鼠血清中细胞因子水平检测
取“2.4”项下血清样品适量,按照ELISA试剂盒说明书方法检测小鼠血清中IL-2、IL-3、IFN-γ、TNF-α水平。
2.7 小鼠全血中白细胞表面标志物水平检测
取“2.4”项下抗凝管中保存的全血样品100μL置于2 m L离心管中,每管加入1μL对应流式抗体(CD3、CD19、CD11b、Mac-3),涡旋混匀;4℃避光孵育30 min,加入红细胞裂解工作液2 m L,充分混匀,4℃裂解5 min;以1 000 r/min离心5 min,使用预冷PBS洗涤白色细胞沉淀1~2次,加入0.2 m L细胞染色缓冲液重悬细胞,采用流式细胞仪检测小鼠全血中白细胞表面标志物水平。
2.8 统计学处理
采用Graphpad Prism 9.0软件进行统计分析。数据以表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较使用LSD-t检验。检验水准α=0.05。
3、结果
3.1 乙酸乙酯部位对WEHI-3细胞增殖的影响
与空白组比较,经不同质量浓度(0.062 5~0.5mg/m L)乙酸乙酯部位干预24、48、72 h后,WEHI-3细胞的增殖抑制率均显著升高(P<0.05)。结果见表1。
表1 各组细胞增殖抑制率检测结果(,n=3,%)
3.2 乙酸乙酯部位对小鼠一般情况的影响
与未造模的小鼠比较,造模后小鼠的运动状态和精神状态逐渐下降,体重逐渐增加,这可能与小鼠腹部体积增大、腹水增多有关。与模型组比较,阳性对照组和乙酸乙酯部位高剂量组小鼠体重减少,运动状态和精神状态均改善。
3.3 乙酸乙酯部位对小鼠肝、脾指数及肝组织病理学形态的影响
与空白对照组相比,模型组小鼠的肝、脾指数显著升高(P<0.05);与模型组相比,阳性对照组和乙酸乙酯部位高剂量组小鼠的肝、脾指数显著降低(P<0.05),乙酸乙酯部位低剂量组小鼠的脾指数显著降低(P<0.05)。结果见表2。
表2 各组小鼠肝、脾指数检测结果(,n=10,%)
病理学形态观察结果(图1)显示,空白对照组小鼠肝细胞未见明显炎症细胞浸润,且无淤血现象;模型组小鼠肝实质可见大量髓外造血细胞增生(绿色箭头)、少量静脉淤血(橙色箭头)和淋巴细胞点状浸润(红色箭头);各给药组小鼠肝组织多见肝细胞颗粒变性和细胞质淡染,可见嗜酸性粒细胞(棕色箭头),肝实质偶有淋巴细胞浸润,几乎无炎症细胞浸润。
3.4 乙酸乙酯部位对小鼠血液学和白细胞分化的影响
与空白对照组比较,模型组小鼠的白细胞计数显著增加(P<0.05),血红蛋白水平、红细胞比容、红细胞平均血红蛋白量、红细胞平均血红蛋白浓度均显著降低(P<0.05)。与模型组比较,阳性对照组和乙酸乙酯部位高剂量组小鼠白细胞数量显著减少(P<0.05),血红蛋白水平和红细胞比容均显著升高(P<0.05)。结果见表3。
图1 各组小鼠肝组织病理学形态观察结果(HE染色)
表3 各组小鼠血液学分析结果(,n=10)
与空白对照组比较,模型组小鼠的中性粒细胞计数、单核细胞计数、嗜酸性粒细胞计数均显著增加(P<0.05)。与模型组比较,阳性对照组和乙酸乙酯部位高剂量组小鼠上述细胞计数均显著减少(P<0.05),乙酸乙酯部位低剂量组小鼠嗜酸性粒细胞计数显著减少(P<0.05)。结果见表4。
表4 各组小鼠白细胞分化结果(,n=10,×109 L-1)
3.5 乙酸乙酯部位对小鼠血清中细胞因子水平的影响
与空白对照组比较,模型组小鼠血清中IL-2、IL-3、IFN-γ水平均显著降低(P<0.05),TNF-α水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较,各给药组小鼠血清中上述指标水平(乙酸乙酯部位低剂量组IFN-γ水平除外)均显著逆转(P<0.05)。结果见表5。
表5 各组小鼠血清中细胞因子水平的检测结果(,n=10,pg/m L)
3.6 乙酸乙酯部位对小鼠全血中白细胞表面标志物水平的影响
与空白对照组比较,模型组小鼠全血中白细胞表面CD3、CD19抗体水平均显著降低,CD11b、Mac-3抗体水平均显著升高(P<0.05)。与模型组比较,各给药组小鼠全血中上述白细胞表面标志物水平均显著逆转(P<0.05)。结果见表6。
表6 各组小鼠全血中白细胞表面标志物水平的检测结果(,n=10,%)
4、讨论
白血病是造血系统的恶性疾病,也是我国十大高发恶性肿瘤疾病之一,其治疗手段复杂,容易加重患者经济负担。中药具有多环节、多靶点、多途径的特点,毒性弱、副作用少,目前已有多种中药有效成分被发现具有抗白血病活性[7]。本研究细胞实验结果显示,含羞草根的乙酸乙酯部位可抑制WEHI-3细胞增殖。在白血病早期阶段,患者血液中淋巴细胞增多是主要的临床表现之一,且随着时间的推移,患者容易出现淋巴结肿大、肝脾肿大以及肝血管淤滞现象[8,9]。本研究体内实验结果显示,模型组小鼠随着造模时间的延长,其精神状态逐渐下降,且由于腹水的生成导致其体重增加,全血中白细胞计数增加,肝、脾指数升高,肝实质可见大量髓外造血细胞增生等;经乙酸乙酯部位干预后,上述指标均有所改善,这提示乙酸乙酯部位可抑制白血病细胞异常增殖,改善AML模型小鼠的病理症状。
IL-2能够激活T细胞和刺激自然杀伤(natural killer,NK)细胞,从而增强NK细胞的杀伤活性,进而识别并攻击白血病细胞[10]。IL-3在调节机体造血功能方面具有重要作用,可增强机体对肿瘤细胞的杀伤作用[11]。IFN-γ可通过提高免疫调节功能,增强机体对恶性肿瘤的防御作用。TNF-α与肿瘤细胞的凋亡和转移有关[12]。机体中CD3和CD19抗体的表达水平升高,反映出机体识别和杀伤肿瘤细胞的能力增强[13,14];机体中CD11b和Mac-3抗体的表达水平降低,反映出肿瘤的感染和转移潜力降低[15]。本研究结果显示,经乙酸乙酯部位干预后,小鼠血清中IL-2、IL-3、IFN-γ水平和全血中白细胞表面CD3、CD19抗体水平均上调,血清中TNF-α水平和白细胞表面CD11b、Mac-3抗体水平均下调。这提示乙酸乙酯部位可能是通过增强小鼠的免疫功能,抑制模型小鼠体内白血病细胞的异常增殖。
综上所述,含羞草根乙酸乙酯部位可抑制WEHI-3细胞增殖,改善AML模型小鼠症状,其作用机制与增强机体免疫功能有关。
参考文献:
[1]张晓丹,周永明,严静贤.中医药治疗急性髓系白血病的研究进展[J].中国中医急症,2020,29(5):925-929.
[2]吕国庆,张肖肖,吴隼,等.急性单核细胞白血病的临床特点及预后分析[J].现代肿瘤医学,2022,30(17):3199-3203.
[3]王卫东,何小花,杨庆敏,等.治疗急性髓系白血病的中药活性成分研究进展[J].时珍国医国药,2021,32(6):1444-1449.
[7]马嘉鑫,刘永忠,李文宏,等.中药逆转白血病多药耐药机制研究进展[J].江西中医药大学学报,2022,34(4):120-124.
[9]卢聪,吴耀辉,胡俊斌.急性白血病患者早期危重症概述[J].临床血液学杂志,2024,37(3):156-161.
[10]杨莹,关红梅,王舒,等.脑脊液与血清IGF-1、IGF-2、IGFBP-3、IL-2、IL-6、IL-8在急性淋巴细胞性白血病中的表达水平及意义[J].热带医学杂志,2020,20(11):1438-1441.
[12]张小梅,陈莉.细胞因子IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ在急性白血病患者感染中的诊断价值[J].中国处方药,2021,19(4):143-145.
[13]成娟,马海珍,张豪.急性白血病患者T、B淋巴细胞的检测与分析[J].中国实验血液学杂志,2019,27(2):327-330.
[14]白会恩,闫理想,林旭,等. CD19在急性髓系白血病中的研究进展[J].疑难病杂志,2023,22(4):441-444.
[15]杨翀,张毅.嵌合抗原受体T细胞治疗恶性肿瘤的研究进展[J].天津药学,2023,35(2):72-78.
基金资助:国家重点研发计划项目(No.2018YFC1707100);广东省重点领域研发计划项目(No.2020B111112-0002);
文章来源:邓婉柔,李慧敏,曾元宁,等.含羞草根乙酸乙酯部位对急性髓系白血病小鼠的影响[J].中国药房,2024,35(11):1315-1319.
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t(16;21)(q24;q22)是一种罕见的白血病染色体异常,位于16号染色短臂2区4带上的髓系易位基因(myeloid translocation gene, MTG16)与21号染色体短臂2区2带上的急性髓系白血病1基因(acute myeloid leukemia 1,AML1)发生融合,该融合基因参与诱导白血病的发生[2]。
2024-09-02白血病患儿(0~17岁)是其中的一个特殊群体[3]。白血病是儿童和青少年常见的癌症之一,根据世界卫生组织的数据,全球每年约有35万人被诊断出患有白血病,其中儿童和青少年占到了20%左右。随着医疗和护理技术的发展,白血病患儿的幸存率逐年提高[4]。
2024-08-26急性髓系白血病(Acute myelogenous leukemia, AML)为白血病主要类型之一,成人发病率较高且治疗效果较差,对患者生命造成较大威胁。AML占儿童急性白血病的15%~20%,但却占因白血病患儿死亡人数的50%以上,其发病机制不明,且具有高侵袭及高转移的特点,严重影响患者预后,因此了解发病机制及寻找新的治疗方法对于改善患儿生存具有重要意义。
2024-08-22研究发现,中性粒细胞与淋巴细胞比值(NLR)、淋巴细胞与单核细胞比值(LMR)及肾母细胞瘤基因1(WT1)基因表达与AML存在一定的关系,但在儿童AML患者中研究仍较少,本文通过研究上述指标NLR、LMR及WT1基因在AML患儿中的表达情况及诊断价值,旨在为此类患儿的精准诊断进一步提供临床依据[4]。
2024-08-19混合表型急性白血病(mixed-phenotype acute leukemia,MPAL)是急性白血病中淋系和髓系同时受累的一种罕见疾病,根据白血病细胞的来源及抗原表达的不同可将其分为双表型、双系列和系列转换型三种,通过免疫学及细胞遗传学结果可对其诊断。一些研究表明,MPAL的预后较差,对于MPAL目前还没有统一的治疗方法[1-2]。
2024-08-13流行病学指出,国内白血病发病率为3/10万~5/10万,且呈逐年递增态势[1-2]。白血病在儿童恶性肿瘤致死中居首位,属于血液系统恶性病变,对儿童身体健康乃至生命安全造成严重威胁[3]。随着近些年医疗技术不断成熟,白血病患儿治愈人数日益增加,生存率明显提高。
2024-08-12急性淋巴细胞白血病(ALL)是急性白血病的一种类型,年发病率为3/10万~5/10万,主要起源于B系或T系淋巴祖细胞,白血病细胞在骨髓内异常增生和聚集并抑制正常造血,导致贫血、血小板减少和中性粒细胞减少;白血病细胞也可侵犯骨髓外组织,如脑膜、性腺、胸腺、肝、脾、淋巴结、骨组织等,引起相应病变。
2024-07-31白血病为造血干细胞的恶性克隆性疾病。该病在临床具有较高的发生率,其发生与免疫功能异常紧密相关[1-2]。近年来随着城市发展、人们生活习惯转变,白血病发生率呈逐年上升趋势。临床为控制患者病情的进一步恶化,通常选用化疗治疗白血病[3-4]。
2024-07-30急性髓系白血病(AML)是一种骨髓造血干/祖细胞恶性肿瘤,以骨髓和外周血中原始细胞的异常增殖为特征,是成人急性白血病中最常见的类型。虽然临床上强化化疗和同种异体造血干细胞移植取得了较大的进展,但由于疾病的难治性、复发性和耐药性等特点,导致大多数AML患者的预后仍较差,其5年生存率仅约为24%。
2024-07-29高白细胞急性白血病(hyperleukocytic acute leukemia, HAL)患者由于过多的白血病细胞在心、脑和肺等器官瘀滞,导致患者早期死亡率高达30%-54%。白血病细胞在肺内瘀滞引起的呼吸困难是白细胞瘀滞的最常见症状,严重者可发生急性呼吸窘迫综合征,需要呼吸机辅助通气,即使入住ICU并予机械通气后仍预后极差。
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