肺癌是全球发病率最高的恶性肿瘤之一，是男性死亡的第一因素和女性死亡的第二因素[1]。在我国，根据2022年国家癌症中心数据显示，每年肺癌新发约82.81万例，死亡约65.70万例，新发及死亡人数均居恶性肿瘤之首[2]。肺癌发现后一般已处于中晚期，且缺乏有效的治疗手段，使得肺癌患者的五年生存率极低，仅为4%～17%[3]。因此迫切需要探索更好的中晚期肺癌治疗方法。雷公藤甲素是从雷公藤根部分离出的一种二萜三氧化二酯，具有显著的抗炎、免疫抑制和抗肿瘤作用。雷公藤甲素在癌症治疗中的效果已有报道，对肝癌、胰腺癌、白血病、子宫癌和胆管癌等多种恶性肿瘤均具有很好的疗效[4]，但是否可以治疗肺癌及其机制仍需进一步探索。本研究将探讨铜死亡在雷公藤甲素治疗肺癌中的分子机制，为其临床应用提供理论支持。

1、材料与方法

1.1 材料

人肺癌细胞系A549和H460购自中国医学科学院细胞库；雷公藤甲素（纯度99.8%）和线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）购自上海MCE公司；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）购自北京索莱宝公司；胎牛血清和四硫钼酸铵购自美国Sigma-Aldrich公司；RPMI培养基购自美国Hyclone公司；铜离子荧光探针购自北京Biofount公司；一抗FDX1、POLD1、SDHB抗体均购自美国Abcam公司；LIAS购自武汉Proteintech公司；DLAT购自美国Cell Signaling Technology公司；β-actin和GAPDH购自北京兰博利德公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

A549和H460细胞铺于T25细胞培养瓶中，使用含10%胎牛血清、100 U/ml链霉素、100 U/ml青霉素的RPMI培养基，在5%CO2、37℃条件下培养。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖

取200μl对数生长期（80%细胞融合度）的A549和H460细胞悬液接种于96孔板中（3×103/孔），置于5%CO2的37℃培养箱中培养过夜，然后每孔分别加入0、25、50、100、200、400 nmol/L的雷公藤甲素处理，每组设5个复孔。培养所需时间后每孔加入20μl浓度为5 mg/ml的MTT溶液，置于37℃恒温培养箱反应4 h，弃去培养基，每孔加入150μl的DMSO溶液，避光反应10 min，置酶标仪于490 nm测定各孔的光密度值（OD）。细胞存活率=（OD实验组–OD空白组）/（OD对照组–OD空白组）×100%。应用Graph Pad Prism 9软件计算IC50值。

1.2.3 Ed U细胞增殖检测

Ed U检测使用Beyo Click™Ed U-488细胞增殖检测试剂盒进行。取对数生长期的A549和H460细胞接种于6孔板中（1×105个/孔）。在细胞进行相应处理并培养24 h后，将37℃预热的2×的Ed U工作液（20μmol/L），等体积加入6孔板中，使6孔板中的Ed U终浓度变为1×，继续孵育细胞2 h。去除培养液，4%的多聚甲醛室温固定15 min，并用0.3%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）通透15 min，然后在Click反应液中室温避光孵育30 min，最后在Hoechst 33342染液中室温避光孵育10 min；荧光倒置显微镜下观察细胞增殖活性。

1.2.4 Transwell迁移实验

取对数生长期的A549和H460细胞，胰蛋白酶消化并吹打成单细胞悬液，细胞计数后，以每孔200μl无血清培养基重悬的3×104个细胞接种于24孔板中的Transwell小室的上室，下室加入600μl含10%胎牛血清的RPMI培养基。在雷公藤甲素处理24 h后，4%多聚甲醛中固定30 min,0.3%结晶紫染色30 min，拍照计数。

1.2.5 铜离子浓度检测

用雷公藤甲素处理A549和H460细胞48 h，向培养基中加入Cu2+荧光探针使其工作浓度为10μmol/L，并将A549和H460细胞在37℃下避光孵育20 min。除去染料工作溶液，用生长培养基洗涤两次，并在荧光显微镜下观察。

图1 雷公藤甲素抑制A549和H460细胞活力（A：不同浓度雷公藤甲素作用不同时间对A549细胞的抑制作用；B：不同浓度雷公藤甲素作用不同时间对H460细胞的抑制作用；C：雷公藤甲素作用48 h对A549细胞的抑制作用；D：雷公藤甲素作用48 h对H460细胞的抑制作用）

1.2.6 线粒体膜电位检测

在细胞进行相应处理并培养48 h后，去除培养液，加入预热好的含10μg/ml JC-1的无血清细胞培养基，于37℃、5%CO2培养箱孵育20 min，去除工作液，无血清细胞培养基清洗两次后荧光显微镜观察。

1.2.7 Western blot检测

使用含1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液于冰上裂解A549和H460细胞30 min，收集细胞总蛋白进行2,2′-联喹啉-4,4′-二甲酸二钠（BCA）法蛋白定量。用10%或12%SDS-聚丙烯酰胺分离20μg总蛋白质并转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，在室温下用5%脱脂奶粉封闭2 h。然后用相应一抗在4℃孵育过夜，经3次TBST洗涤后，将膜在HRP偶联的二抗（1:5000）中室温孵育2 h。使用增强的化学发光蛋白质印迹检测试剂使蛋白质可视化，将PVDF膜在凝胶成像系统上进行分析。

1.3 统计学处理

应用SPSS 26.0软件统计分析，使用Graph Pad Prism 9.0制作统计图。计量资料符合正态分布，以表示，两组间数据比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 雷公藤甲素抑制A549和H460细胞增殖

MTT检测细胞增殖活力实验表明，雷公藤甲素以时间和浓度依赖性的方式抑制A549和H460细胞增殖（图1A、B），雷公藤甲素作用48 h的IC50分别为74.67 nmol/L（图1C）和34.12 nmol/L（图1D）。此外，Ed U细胞增殖实验进一步验证了雷公藤甲素对A549和H460细胞增殖的抑制作用，雷公藤甲素组较对照组细胞增殖活力显著降低（图2）。

2.2 雷公藤甲素抑制A549和H460细胞迁移

Transwell迁移实验（图3）表明，在100 nmol/L雷公藤甲素处理24 h后，雷公藤甲素组中A549和H460细胞迁移的细胞数量较对照组显著减少（P<0.05）。

图2 雷公藤甲素抑制A549和H460细胞增殖（A:Ed U染色荧光图片；B：统计结果；对照组为常规条件培养24 h，雷公藤甲素组为100 nmol/L雷公藤甲素干预24 h;**P<0.01,***P<0.001)   

图3 雷公藤甲素抑制A549和H460细胞迁移（A:Transwell迁移染色；B：统计结果；对照组为常规条件培养24 h，雷公藤甲素组为100 nmol/L雷公藤甲素干预24 h;**P<0.01)   

2.3 雷公藤甲素破坏A549和H460细胞线粒体膜电位

在雷公藤甲素处理后，采用JC-1荧光探针检测A549和H460细胞线粒体膜电位变化（图4），观察到A549和H460细胞雷公藤甲素组较对照组绿色荧光增加（P<0.05），表明雷公藤甲素组中细胞的线粒体膜电位被破坏。

2.4 雷公藤甲素诱导A549和H460细胞铜死亡

在雷公藤甲素处理后，采用铜离子荧光探针检测A549和H460细胞中铜浓度（图5），观察到雷公藤甲素组较对照组红色荧光增加（P<0.05），这表明雷公藤甲素处理提高了A549和H460细胞中铜浓度。此外，采用Western blot检测了铜死亡相关蛋白的变化（图6）。结果显示，与对照组相比，雷公藤甲素组中铁硫簇蛋白FDX1、POLD1、SDHB、LIAS和脂酰化蛋白DLAT单体表达下调，DLAT寡聚体表达增加。在此基础上，进一步检测雷公藤甲素对细胞内铜稳态调节蛋白CTR1、ATP7A和ATP7B表达的影响（图7），结果表明，与对照组相比，雷公藤甲素组中铜转入蛋白CTR1表达无明显变化，而铜输出蛋白ATP7A和ATP7B表达下调。以上结果表明，雷公藤甲素通过下调ATP7A和ATP7B表达，升高细胞内铜离子浓度，进而诱导A549和H460细胞铜死亡。

2.5 铜离子螯合剂减轻雷公藤甲素诱导铜死亡的效果

使用铜离子螯合剂四硫钼酸铵（TTM）预处理细胞后，再加入雷公藤甲素处理。采用Western blot检测雷公藤甲素组与铜离子螯合剂TTM和雷公藤甲素联合处理组中铜死亡相关蛋白的变化（图8），结果显示，与雷公藤甲素组相比，铜离子螯合剂TTM和雷公藤甲素联合处理组中铁硫簇蛋白FDX1、POLD1、SDHB、LIAS和脂酰化蛋白DLAT单体表达上调，DLAT寡聚体表达下调（P<0.05）。结果表明铜离子螯合剂四硫钼酸铵可以减轻雷公藤甲素诱导铜死亡的效果。

3、讨论

肺癌是全球发病率最高的肿瘤之一，其死亡率也高居恶性肿瘤的前列。肺癌的治疗方式主要包括外科手术、放射治疗以及药物治疗。但是早期的肺癌基本上没有明显的症状，大部分肺癌患者被发现时已经进入了中晚期，目前的治疗手段对预后的改善效果不佳。急需为肺癌患者找到新的治疗靶点或者药物。近年来，传统中药抗癌作用逐渐被报道，中药治疗能够有效辅助西医治疗增效减毒[5,6]。本研究通过MTT实验和Ed U细胞增殖实验证实了雷公藤甲素以剂量和时间依赖性的方式抑制A549和H460细胞增殖，通过Transwell迁移实验证实了雷公藤甲素抑制A549和H460细胞迁移，但其确切作用机制尚不明确。

图4 雷公藤甲素破坏A549和H460细胞线粒体膜电位（A:JC-1荧光探针染色；B：统计结果；对照组为常规条件培养48 h，雷公藤甲素组为100 nmol/L雷公藤甲素干预48 h;*P<0.05,***P<0.001)  

图5 雷公藤甲素增加A549和H460细胞内铜浓度（A：铜离子荧光染色；B：统计结果；对照组为常规条件培养48 h，雷公藤甲素组为100 nmol/L雷公藤甲素干预48 h;*P<0.05)  

图6 雷公藤甲素对铜死亡相关蛋白的影响（A:A549细胞Western blot结果；B:H460细胞Western blot结果；C:A549细胞相对蛋白含量统计结果；D:H460细胞相对蛋白含量统计结果；对照组为常规条件培养48 h，雷公藤甲素组为100 nmol/L雷公藤甲素干预48 h;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)   

铜是一种矿物质营养素，越来越多研究证实其参与细胞增殖和死亡途径[7,8]。铜是酶介导细胞基本功能所必需的辅因子，包括线粒体呼吸，抗氧化防御以及激素、神经递质和色素的生物合成，但同时铜浓度的失调会导致氧化应激和细胞毒性[9,10]。在本研究中，通过铜离子荧光探针检测到雷公藤甲素处理后的A549和H460细胞内铜浓度的增加，据此推测雷公藤甲素抑制肺癌细胞增殖和迁移可能与细胞铜浓度的增加有关。细胞内的铜稳态主要通过铜转入蛋白CTR1和铜输出蛋白ATP7A、ATP7B维持[11]。因此检测相关蛋白的表达变化，结果显示铜转入蛋白CTR1在雷公藤甲素处理后无明显变化，而铜输出蛋白ATP7A、ATP7B在雷公藤甲素处理后表达下调，可以推测雷公藤甲素引起A549和H460细胞内铜浓度增加的机制是下调铜输出蛋白。但是铜与细胞死亡具体机制一直不明确，直到2022年Science上的一文揭示了细胞内铜死亡的机制[12]。铜死亡是一种由细胞内铜离子过度积累导致线粒体内脂酰化蛋白异常聚集并干扰线粒体呼吸相关的铁硫簇蛋白，引起蛋白质毒性应激反应，最终导致细胞死亡的方式[12,13]。铜死亡主要靶点是细胞内的线粒体，引起线粒体功能的丧失并导致细胞死亡。因此，本研究采用JC-1荧光探针检测对照组与雷公藤甲素组细胞中线粒体膜电位变化，发现雷公藤甲素破坏了A549和H460细胞线粒体膜电位，进一步验证了雷公藤甲素抑制肺癌细胞增殖和迁移可能与铜死亡有关。肿瘤细胞代谢状态决定了其对铜死亡的敏感程度，高有氧呼吸水平的肿瘤更容易发生铜死亡[14]。许多研究表明，与正常细胞相比，部分癌症细胞会表达大量脂酰化的线粒体蛋白，并表现出高强度的呼吸作用，如肺癌、黑色素瘤、乳腺癌和白血病等[14,15,16]。本研究探究雷公藤甲素是否可以诱导肺癌细胞铜死亡，进而抑制肺癌细胞增殖与迁移。采用Western blot检测肺癌细胞中铜死亡通路蛋白的变化，实验结果表明，在雷公藤甲素处理后，铁硫簇蛋白FDX1、LIAS、POLD1、SDHB表达均下降，脂酰化蛋白DLAT单体表达下降，而DLAT寡聚体增加。铁硫簇蛋白中FDX1和LIAS是负责蛋白质脂酰化的两种关键蛋白[12,17,18,19]，蛋白质脂酰化是一种高度保守的赖氨酸翻译后修饰，是三羧酸循环中关键酶的必要成分[17,19,20]。DLAT是丙酮酸脱氢酶复合体中的一种脂酰化蛋白，在细胞内游离铜过度累积时，脂酰化蛋白DLAT形成具有毒性的寡聚体，导致细胞死亡[12,17,21]。以上结果表明雷公藤甲素在A549和H460细胞中下调铁硫簇蛋白表达、增加DLAT寡聚体表达诱导了铜死亡。此外，进一步使用铜离子螯合剂四硫钼酸铵探索其对雷公藤甲素所诱导的铜死亡效果，结果显示铜离子螯合剂可以减轻雷公藤激素诱导的铜死亡。

图7 雷公藤甲素对铜稳态调节蛋白的影响（A:A549细胞Western blot;B:H460细胞Western blot;C:A549细胞的相对蛋白含量统计结果；D:H460细胞的相对蛋白含量统计结果；对照组为常规条件培养48 h；雷公藤甲素组为100 nmol/L雷公藤干预48 h;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,ns:Not significant)   

总之，我们报告了一种新的雷公藤甲素抗肿瘤机制，即诱导肿瘤细胞发生铜死亡。这些发现不仅确定了雷公藤甲素的新靶点，也为其在肺癌治疗中的临床应用提供了理论参考。

图8 铜离子螯合剂TTM对雷公藤甲素诱导铜死亡的影响（A:A549细胞Western blot;B:H460细胞Western blot;C:A549细胞的相对蛋白含量统计结果；D:H460细胞的相对蛋白含量统计结果；对照组为常规条件培养48 h；雷公藤甲素组为100 nmol/L雷公藤甲素干预48 h;TTM+雷公藤甲素组为TTM 40μmol/L预处理2 h后使用100 nmol/L雷公藤甲素干预48 h；与雷公藤甲素组比较，#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001)

文章来源:肖艳霞,刘璞,郭君,等.雷公藤甲素诱导肺癌细胞铜死亡的机制研究[J].中国医药生物技术,2024,19(02):135-143.