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miR-451及靶基因在非小细胞肺癌中的表达与调控研究

2024-08-16 21 上传者：管理员

摘要：目的探讨miR-451及靶基因PSMB8在非小细胞肺癌中的表达及其与相关细胞周期蛋白的相关性，为非小细胞肺癌的治疗提供新的靶点。方法选取2020年1月至2022年12月该院胸外科行肺癌根治术的6例肺癌患者组织标本，将其按癌组织和癌旁组织进行分组，各6份。比较2组miR-451、蛋白酶体β亚单位8（PSMB8）、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、Cyclin E1、细胞周期素依赖激酶4（CDK4）、CDK2蛋白相对表达水平，分析miR-451与相关细胞周期蛋白的相关性。结果肺癌组织组miR-451的CT值高于癌旁组织组，差异有统计学意义（P<0.05）。肺癌组织组miR-451的2-ΔΔCT值为0.53,癌旁组织组miR-451相对表达量是肺癌组织组的1.87倍。肺癌组织组PSMB8相对表达水平为（1.55±0.23）,明显高于癌旁组织组的（0.98±0.15）,差异有统计学意义（P<0.05）。肺癌组织组Cyclin D1、Cyclin E1、CDK4、CDK2蛋白相对表达水平明显高于癌旁组织组，差异有统计学意义（P<0.05）。miR-451相对表达水平与Cyclin D1、Cyclin E1、CDK4、CDK2蛋白相对表达水平呈负相关（r=-0.93、-0.89、-0.86、-0.84,P<0.05）。结论肺癌组织中miR-451低表达，可减少对靶基因PSMB8表达的抑制作用，进而干扰细胞周期相关蛋白的表达，影响细胞增殖和凋亡，从而间接调控肺癌的发生发展。

关键词：
免疫抑制剂
恶性肿瘤
细胞周期蛋白
非小细胞肺癌
靶基因
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肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，已成为我国城市人口恶性肿瘤死亡原因的第1位[1]。非小细胞肺癌约占所有肺癌的80%,约75%的患者发现时已处于中晚期，其5年生存率很低[2-4]。虽然，大量针对非小细胞肺癌的靶向药及免疫抑制剂被批准应用于临床，但很多患者在使用过程出现耐药现象。近年来，随着对非编码RNA研究的深入，miRNA在机体中所构建的调控网络及其对靶基因的调控机制被逐渐探明，但其在肿瘤发病中的作用有待进一步验证。因此，探讨miRNA在非小细胞肺癌发病机制中的作用，寻求新的治疗靶点成为研究者关注的热点。本研究以miR-451为研究靶点，通过分析miR-451在癌组织和癌旁组织中的相对表达量，探讨其对靶基因PSMB8表达抑制作用的强弱，并以细胞周期相关蛋白的表达水平评价其对细胞增殖和凋亡的影响，为进一步揭示miRNA在非小细胞肺癌发生发展中的作用奠定基础。

1、资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料

选取2020年1月至2022年12月本院胸外科行肺癌根治术的6例肺癌患者组织标本，将其按癌组织和癌旁组织进行分组，各6份。患者年龄45～68岁，均为原发性肺癌，未出现多种肿瘤并发现象。本研究经医院医学伦理委员会审核批准。

1.1.2 主要试剂与仪器

7500型实时定量PCR仪购自美国ABI公司，Trizol、逆转录试剂盒购自美国Invitrogen公司，聚偏氟乙烯电转膜购自美国Millipore公司，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自美国OMEGA公司，丙烯酰胺购自美国Amresco公司，UVP-GDS8000凝胶成像系统购自美国UVP公司，电泳仪购自美国Bio-Rad公司，移液器购自德国Eppendorf公司，聚合酶链反应(PCR)扩增仪购自日本Thermo公司，实时荧光定量PCR(RT-PCR)试剂盒购自日本TaKaRa公司，免疫印迹法(Western blot)实验仪购自上海天能科技有限公司，曝光用显影粉/定影粉购自天津市鑫洋医疗器械有限公司，生物安全柜购自江苏苏净安泰公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR检测

检测肺癌组织及癌旁组织miR-451、蛋白酶体β亚单位8(PSMB8)的相对表达水平。采用Trizol法提取总RNA,在逆转录反应体系下进行逆转录，体系条件设定如下：16 ℃ 10 min, 37 ℃ 30 min, 65 ℃ 15 min, 4 ℃左右保存。将miR-451反转录为第一链cDNA,再以其为模板，在PCR扩增仪中进行扩增，条件设置如下：引物10 pmoL/L;95 ℃变性10 min, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 40个循环。选定U6为内参，以目的基因与内参基因之间相对表达水平作为目的基因表达量，并采用2-ΔΔCt方法计算相对表达量。

1.2.2 Western blot检测

取出待测标本组织，在低温条件下充分碾磨后按常规方法提取总蛋白。每管加入10%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)蛋白上样缓冲液，充分混匀后沸水浴加热3～5 min, 使目的蛋白变性。目的蛋白冷却到室温后，上样至SDS-PAGE胶加样孔内。经聚丙烯酰胺凝胶电泳处理后，转移至聚偏二氟乙烯膜上，放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1～2 min, 以洗去膜上的转膜液。滴管吸尽洗涤液，加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60 min。吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，4 ℃缓慢摇动孵育过夜。结合一抗过夜后，用缓冲液清洗3次，每次5 min, 加入二抗室温孵育2 h, 用缓冲液清洗3次，每次5 min, 加入增强化学发光显色剂，压片曝光、显影。选取稳定表达于癌旁组织和肺癌组织中的β-Actin蛋白作为内参，以目标蛋白和内参蛋白条带灰度值的比值作为目标蛋白表达的相对含量，经蛋白灰度分析软件Quantity one扫描，计算细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、Cyclin E1、细胞周期素依赖激酶4(CDK4)、CDK2蛋白相对表达量。

1.3 统计学处理

RNA及蛋白质相对表达量原始数据统一录入SPSS20.1软件。计量资料以

表示，组间比较采用配对样本t检验，miR-451与细胞周期蛋白表达量的相关性采用Pearson相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 2组miR-451基因扩增结果比较

肺癌组织组miR-451的CT值高于癌旁组织组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。肺癌组织组miR-451的2-ΔΔCt值为0.53,癌旁组织组miR-451相对表达量是肺癌组织组的1.87倍。肺癌组织组PSMB8相对表达水平为(1.55±0.23),明显高于癌旁组织组的(0.98±0.15),差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.2 2组Cyclin D1、Cyclin E1、CDK4、CDK2蛋白相对表达水平比较

肺癌组织组Cyclin D1、Cyclin E1、CDK4、CDK2蛋白相对表达水平明显高于癌旁组织组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表1 2组miR-451基因扩增结果比较

图1 2组PSMB8表达情况

表2 2组Cyclin D1、Cyclin E1、CDK4、CDK2蛋白相对表达水平比较

3、讨论

肺癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，已位列恶性肿瘤致死原因第1位，其中非小细胞肺癌发病率为80%～85%[5]。非小细胞肺癌癌细胞裂变速度慢，扩散转移相较于小细胞肺癌晚，且早期非小细胞肺癌一般无明显临床症状，但发病确诊时多为中晚期，患者预后较差[6]。因此，对非小细胞肺癌发病机制进行研究，寻找新的靶点具有重大意义。

miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，其不直接参与基因的表达。目前，研究者共鉴定超过1 000种miRNA。在对大量真核细胞miRNA分析中，研究者发现在不同组织或同一组织不同发育阶段，miRNA的水平具有明显差异性。该特征与其他参与靶基因调控的生物大分子表达具有一致的特性。因此，研究者推测其在细胞内具有多种重要的调节作用。随着对miRNA研究的深入，其在生物体内成熟过程逐渐被认知。从原始pri-miRNA到miRNA前体即pre-miRNA,最终在Dicer酶酶切后形成具有发夹结构的成熟miRNA。每个成熟miRNA参与1个或多个靶基因调控，同时不同miRNA也可共同靶向调控同一基因，从而在机体中构建完善的miRNA调控网络。miRNA完成对靶基因的调控主要通过2种机制实现：一是通过与mRNA互补结合，诱导mRNA被切割，破坏靶基因的稳定性；二是与mRNA不完全结合，在不破坏mRNA前提下抑制蛋白质表达。大量基础研究结果证实，miRNA通过与mRNA结合，影响靶向基因的稳定性或抑制靶向基因的蛋白翻译表达，从而间接参与细胞代谢、增殖、分化、凋亡等过程[7-8]。

ALTUVIA等[9]在2005年于人脑垂体RNA中提取miR-451,其位于染色体17q11.2。近年来，研究者发现miR-451的生成不依赖Dicer切割，而与Argonaute催化酶活性密切关联[10]。这种特殊生成途径在生物发育过程中必然发挥重要作用。大量研究发现，miR-451在胶质瘤[11]、胃肠肿瘤[12-13]、肺癌[14-15]等肿瘤组织中呈低表达。体外实验上调miR-451表达可显著抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭。因此，有理由相信，miR-451在非小细胞肺癌中的异常表达，可能通过影响细胞周期相关蛋白的表达，进而逃逸细胞周期的限制，最终导致细胞恶性增殖，诱发肿瘤形成。本研究以miR-451为导向，探讨其对肺癌细胞中Cyclin D1、Cyclin E1、CDK4、CDK2蛋白的影响，为更好地了解肺癌发病机制提供了参考和依据。本研究结果显示，癌旁组织中miR-451表达量是肺癌组织的1.87倍，而肺癌组织中PSMB8表达量显著增加。肺癌组织中Cyclin D1、Cyclin E1、CDK4、CDK2蛋白相对表达水平明显高于癌旁组织。高表达的细胞周期调控因子Cyclin D1能和CDK4形成复合物，进而使Rb蛋白磷酸化，释放E2F转录因子1,驱动肿瘤细胞从G1期进入S期。同样，肺癌细胞中Cyclin E1高表达，通过激活CDK2并与之形成复合物，促进细胞通过细胞周期G1/S期限制点。Cyclin D1、Cyclin E1的过度表达可引起细胞增殖失控，从而造成细胞异常增殖，最终诱发正常细胞癌变[16-17]。癌旁组织中miR-451可通过与PSMB8互补结合，破坏PSMB8稳定性而降低PSMB8表达水平。肺癌组织中miR-451低表达，导致对靶基因表达的抑制作用减弱，以及PSMB8表达水平显著增加，进而间接影响细胞周期相关蛋白的表达，干扰细胞增殖与凋亡。miR-451、PSMB8与细胞周期相关蛋白表达的关联性在本研究的相关性分析中得到了进一步验证。

综上所述，miR-451可能通过调控PSMB8的表达进而调控细胞周期调控因子Cyclin D1、Cyclin E1表达，从而促进肿瘤细胞通过细胞周期G1/S期限制点，诱导非小细胞肺癌的发生发展。为进一步证实上述调控机制，本课题组拟在体外培养非小细胞肺癌细胞株NCI-H1975细胞，通过上调和下调miR-451表达，检测细胞周期蛋白表达量及NCI-H1975细胞凋亡和迁移情况，进而在细胞层面探讨miR-451对非小细胞肺癌细胞形态和功能的影响。

参考文献:

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