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玉溪市家鼠鼠疫疫源地鼠疫耶尔森菌噬菌体的分离及鉴定

2024-10-30 110 上传者：管理员

摘要：目的调查云南省玉溪市家鼠鼠疫疫源地宿主动物中是否携带鼠疫耶尔森菌噬菌体，并进行分离鉴定。方法 2018年8月—2019年8月在新平县、峨山县、元江县和红塔区捕鼠。以鼠疫耶尔森菌（简称“鼠疫菌”）EV 76疫苗株为宿主菌，使用双层琼脂平板法进行鼠疫菌噬菌体的分离，对分离而得的部分噬菌体进行初步鉴定。并用PCR法检测鼠疫菌特异基因caf1。结果本次调查共捕获452只鼠类标本，分离到31株鼠疫菌噬菌体，总分离率为6.86%;10株分离自褐家鼠，分离率为5.56%;8株分离自黄胸鼠，分离率为6.61%;6株分离自小家鼠，分离率为10.34%;3株分离自斯氏家鼠，分离率为10.34%;3株分离自大足鼠，分离率为15.79%,1株分离自松鼠，分离率为25.00%。不同宿主动物鼠疫菌噬菌体分离率差异无统计学意义（χ2=10.813,P>0.05）。4个县（区）均分离出鼠疫菌噬菌体，13个采样点中11个采样点分离出鼠疫菌噬菌体，分离率为84.62%。各采样点分离率差异有统计学意义（χ2=27.505,P<0.05）。噬菌体在平板上表现出大（d≥1.8mm）、中（0.8mm≤d<1.8 mm）和小（d<0.8mm）噬菌斑；未检测到caf1基因。结论玉溪市家鼠鼠疫疫源地内存在鼠疫菌噬菌体，噬菌斑呈多态性。3株噬菌体形态符合肌尾噬菌体科特征。

关键词：
分离
初步鉴定
家鼠鼠疫疫源地
玉溪市
鼠疫菌噬菌体
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玉溪市地处云南省中部，辖7县2区，总面积15 285km2。年均气温17.4～23.8℃,年均降雨量670～2 412mm,属中亚热带湿润冷冬高原季风气候。历史上玉溪市是鼠疫流行重灾区，早在1772—1937年，鼠疫死亡人数约73 500人[1]。静息50年后，1992年春季玉溪市元江县发生一起鼠间鼠疫暴发流行，报告9例腺鼠疫病例[2]。1996年新平县暴发一起鼠间鼠疫并波及人间[3]。1997年开始静息，至今未发生动物间和人间鼠疫疫情，疫源地处于静息期[4]。噬菌体是一种能够感染细菌的病毒，由外层蛋白质和包裹在内的核酸组成[5]。鼠疫菌噬菌体依赖于鼠疫菌，有鼠疫菌的存在就有鼠疫菌噬菌体的踪迹[6],其与鼠疫菌在自然界的保存、传播进化，以及鼠疫的流行相关[7]。为了解玉溪市家鼠鼠疫疫源地有无鼠疫菌噬菌体的存在，及其在不同宿主动物的存在情况，选取4个曾流行过鼠疫的地区采集鼠类样本，进行鼠疫菌噬菌体的分离及鉴定。

1、材料与方法

1.1 EV 76菌株

试验用EV 76疫苗株由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供，系云南省地方病防治所鼠疫菌种库保藏。

1.2标本采集与预处理

2018年8月—2019年8月在玉溪市4个曾流行过鼠疫的地区(新平县、元江县、峨山县、红塔区)采集鼠类标本。鼠类经初步鉴定后进行无菌解剖，取其肠道组织剪碎放入10ml改良磷酸盐缓冲液增菌液培养管中，置于4℃冰箱保存。本研究经过医学伦理委员会审批，伦理号：云地所医伦[2024]第10号。

1.3主要仪器设备和试剂

生物安全柜(美国NUAIRE,批号：200012469)、50%磷酸盐缓冲液甘油保存液、冰箱、Millex-GP过滤器0.22μm、恒温气浴振荡培养箱(Ecotron,批号：CH-4103)、溶菌肉汤(Luria-Bertani broth, LB)培养基(固体、半固体、液体)、DNA提取试剂盒(康宁生命科学有限公司，批号：02622990)、PCR扩增仪(SLAN-96S,批号：SN16113407)、电泳仪(DYCP-31DN,批号：0010006571)、GEL DA 2K凝胶成像仪(美国SYNGENE,批号：DR4VZ2272)、日立透射电子显相镜(日本HT7700,批号：HT15134520)。

1.4鼠疫菌噬菌体的分离纯化

用0.22μm的滤器过滤，将滤液加入含有100μl EV 76菌悬液的5ml LB液体培养基中，充分混匀，置于培养箱振荡过夜培养(温度为28℃、转速为230r/min)后过滤。将200μl滤液与100μl EV 76菌液混匀，加入温度冷却至约40℃的LB半固体培养基中，混匀后倒入LB固体培养基中，置28℃恒温箱培养24h后观察噬菌斑。挑取单个噬菌斑加入至含有300μl EV 76菌悬液的LB液体培养基中(30ml),进行单斑增殖4次，获得纯化噬菌体。

1.5电镜下观察鼠疫菌噬菌体

鼠疫菌噬菌体制备：取噬菌体滴加在EV 76鼠疫菌疫苗株的上层平板，置于培养箱中培养20h,挑取大块噬菌斑浸泡于200μl生理盐水中1h,离心取上层液体。醋酸双氧铀负染色，电镜观察。

1.6肠道鼠疫菌caf1基因检测

所有肠道样本均按照DNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)提取步骤进行DNA的制备。所用引物：正向引物序列5′-GGAACCACTAGCACATCTGTT-3′,反向引物序列5′-ACAGCATCAGTGTATTTACCTGCTG-3′,扩增产物长度为266bp。PCR反应体系及条件：总体积20μl,分别为2×Mix 10μl,引物1μl,模板1μl,去离子水8μl;反应设置：95℃,预变性5min; 95℃变性1min, 55℃退火20s, 72℃延伸30s, 30个循环；72℃延伸5min。扩增产物电泳检测1.5%琼脂糖(法国Biowest公司，批号：212395)凝胶电泳110V 30min,通过全自动凝胶成像系统进行成像。

1.7统计学分析

采用Microsoft Excel 2016整理数据；采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，各采样点及各种鼠标本噬菌体分离率比较采用χ2检验，计数资料用百分比表示。以P<0.05为差异有统计学意义。检验水准α=0.05。

2、结果

2.1不同采样点鼠疫菌噬菌体的分离情况

本次调查共捕获452只宿主动物，分离到31株鼠疫菌噬菌体，总分离率为6.86%。玉溪市所辖的新平县、元江县、峨山县和红塔区中均分离到鼠疫菌噬菌体。峨山县分离出14株鼠疫菌噬菌体，分离率为8.86%;元江县分离出7株鼠疫菌噬菌体，分离率为5.26%;新平县分离出4株鼠疫菌噬菌体，分离率为3.15%;红塔区分离出6株鼠疫菌噬菌体，分离率为17.65%。选取的13个采样点中11个采样点分离出鼠疫菌噬菌体，分离率为84.62%。各采样点鼠疫菌噬菌体分离率差异有统计学意义(χ2=27.505,P<0.05)。见表1。

2.2鼠疫菌噬菌体分离情况

此次共捕获452只鼠类标本，主要由家鼠、野鼠及其他野生小鼠构成。家鼠的褐家鼠和黄胸鼠为优势鼠种，分别占标本总数的39.82%和26.77%。各宿主动物鼠疫菌噬菌体分离率差异无统计学意义(χ2=10.813,P>0.05)。见表2。

表1玉溪市不同采样点鼠疫菌噬菌体的分离情况

2.3噬菌斑形态和电镜形态

鼠疫菌噬菌体培养20h后形成直径≥1.8mm、中心清晰透亮的大噬菌斑(见图1A HT3);0.8mm≤直径<1.8mm、边缘较模糊的中噬菌斑(见图1A yJS126);直径<0.8mm的小噬菌斑(见图1A es14)。电镜下可见3株鼠疫菌噬菌体呈蝌蚪形，由头部和尾部构成，头部为多面体结构。es14号鼠疫菌噬菌体头部直径约50nm,尾长80nm; yJS126号鼠疫菌噬菌体头部直径约60nm,尾长86nm。见图1B。

表2玉溪市不同宿主动物鼠疫菌噬菌体的分离情况

图1玉溪市鼠标本中分离的3株鼠疫菌噬菌体的噬菌斑和电镜形态

2.4 PCR检测

所有的鼠标本中，对鼠疫菌的标识基因caf1进行检测，检测结果均为阴性，见图2。

图2鼠疫菌噬菌体肠道样本的caf1引物PCR扩增电泳图

3、讨论

玉溪市为云南省典型的家鼠型鼠疫疫源地，鼠疫经历了流行、静息及再次复燃的流行特征。玉溪市家鼠鼠疫疫源地鼠疫菌噬菌体分离率(6.86%)高于普洱市[6]和梁河县家鼠鼠疫疫源地分离率(1.40%)[8],也高于剑川县和鹤庆县野鼠鼠疫疫源地的分离率(分别为1.40%和0.56%)[9-10],低于玉龙县野鼠鼠疫疫源地的分离率(9.01%)[11],而剑川县、玉龙县、鹤庆县为鼠疫现疫区[12]。在鼠疫流行疫区和历史疫区，均分离出鼠疫菌噬菌体。鼠疫菌噬菌体与鼠疫菌是一种互为依赖的生存关系[13],据此推测鼠疫菌一直存在，样本中分离出鼠疫菌噬菌体，提示可能存在或曾感染过鼠疫菌。从这些标本中却未检测到鼠疫菌的特异基因caf1,可能为鼠疫菌噬菌体的噬菌作用出现非典型化的鼠疫菌[14];也可能为鼠疫流行过后，在人类的介入下重新建立了一种生态平衡，疫源地进入静息期[15],从而未分离出鼠疫菌，又或是鼠疫菌噬菌体的宿主菌裂解谱较宽[16],找到适宜其生存繁殖的宿主菌并抑制鼠疫菌的存在。

本次调查共采集到452只鼠类标本，有180只褐家鼠，占采集总数的39.82%;黄胸鼠121只，占26.77%。玉溪市主要宿主动物为褐家鼠和黄胸鼠，其中褐家鼠的捕获数量最多。云南省褐家鼠中鼠疫菌噬菌体分离率较高的地区为历史疫区玉溪市红塔区[7],主要宿主动物(褐家鼠)与同类型疫源地的德宏傣族景颇族自治州[17]和保山市[18](黄胸鼠)不同。这可能与其生存方式、当地的环境气候、人类的生产生活方式息息相关，褐家鼠繁殖力极强，栖息场所广泛，主要生活在住宅区建筑物里，随着人类住宿环境的提升，其生活环境也发生变化。本次调查主要选择在居民区及其周围区域每隔5m布放鼠夹进行捕捉，故出现褐家鼠为主要宿主动物[4]。本次研究从180只褐家鼠中分离出10株鼠疫菌噬菌体，分离率为5.56%;从121只黄胸鼠中分离出8株鼠疫菌噬菌体，分离率为6.61%。此次从4只松鼠中分离出1株鼠疫菌噬菌体，鼠疫菌噬菌体的存在使松鼠对鼠疫菌的耐受性增加，从而使其成为鼠疫菌远距离传播的一种载体[19]。这提醒松鼠虽然是鼠疫菌的偶然宿主，但在鼠疫防控中不容忽视。

据文献报道，有12株鼠疫菌噬菌体的全基因组测序已经完成，其中的pY100[20]、YpsP-PST[21]和L-413C[22]3株属于肌尾噬菌体科，基因组比对后，其同源性有明显差异[23],说明肌尾病毒科噬菌体的鼠疫菌噬菌体基因组具有遗传多样性特征。本研究选取有代表性的3株鼠疫菌噬菌体进行电镜观察，其形态符合肌尾噬菌体科特征。此次分离的31株鼠疫菌噬菌体的噬菌斑形态呈现多态化，其基因组是否具有多态化呢?这需要笔者下一步对其提取核酸进行全基因组测序比对分析后确定。

基金资助:国家自然科学基金(31660043);云南省高层次卫生技术人才培养经费资助(L-2019001,H-2019003);

文章来源:彭海燕,钟佑宏,张海鹏,等.玉溪市家鼠鼠疫疫源地鼠疫耶尔森菌噬菌体的分离及鉴定[J].医学动物防制,2024,40(12):1145-1148+1153.