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WGCNA分析鉴定宫颈癌放疗预后相关基因

2024-10-12 12 上传者：管理员

摘要：目的：探究宫颈癌放疗前后基因表达差异及其与放疗疗效和宫颈癌预后的关系。方法：本研究通过GEO数据库获取宫颈癌组织放疗前后的基因表达数据，应用WGCNA构建基因共表达网络找到放疗相关的共表达基因模块。进一步通过差异表达分析、生存分析鉴定与宫颈癌放疗预后相关的基因。结果：利用宫颈癌组织的基因表达谱数据（放疗前n=20,放疗后n=30）通过WGCNA分析鉴定出与放疗显著相关的共表达基因模块。针对关联性最强、最显著（r=-0.5,P=0.000 2）的模块进行功能富集分析，结果显示该模块内的基因富集在细胞增殖、凋亡、自噬等生物通路。进一步通过差异表达分析发现HELZ和NEDD4是放疗后显著下调基因（log2FC=-1.54,P=0.000 6,FDR=0.06）和NEDD4（log2FC=-1.13,P=0.001 7, FDR=0.08）。生存分析显示HELZ和NEDD4的高表达与宫颈癌患者生存预后不良相关（Log-rank P<0.05）。结论：本研究通过WGCNA分析识别出宫颈癌放疗相关的共表达基因模块，发现HELZ和NEDD4可能是宫颈癌放疗预后的潜在生物标志物。为深入了解宫颈癌放疗机制和制定个体化治疗方案提供了新的线索。

关键词：
WGCNA
宫颈癌
放疗
生物标志物
预后
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宫颈癌(cervical cancer)是全球范围内最常见的妇科恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在女性癌症患者中排名第四[1]。据统计。每年确诊604 000例宫颈癌新发病例，2020年报告宫颈癌患者死亡人数为342 000例[2]。放疗在宫颈癌不同分期治疗中均起到至关重要的作用[3]。但有研究报道，早期宫颈癌患者在标准治疗后仍有10%～20%的复发率，局部晚期患者的复发率高达70%[4-5],且预后相对较差。放疗是宫颈癌治疗方案中的常用且有效的治疗手段，但仍有部分患者在治疗过程中表现出对放疗的逃逸或耐药现象，导致肿瘤复发和生存率下降，为治疗效果带来了巨大的挑战[6]。其中基因序列、表达水平变异[7]是疗效和预后存在个体差异一个重要的原因。因此，全面了解疾病的分子多样性和肿瘤进展相关的分子途径有助于开发预后预测标志物、优化治疗手段，基于精准治疗方案从而产生有利的肿瘤学结果[8]。随着高通量测序技术的普及，已有研究报道许多预测宫颈癌复发和预后的分子标志物，并构建风险预测模型[9-11]。但是，目前关于利用宫颈癌放疗后差异基因用于评价肿瘤预后的研究尚为欠缺。为此，本研究拟通过GEO数据库获取宫颈癌放疗前和放疗期间的基因表达数据，创新性地应用加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis, WGCNA)识别放疗前后差异基因表达模块，通过差异表达分析、生存分析鉴定与宫颈癌患者放疗预后的相关基因，为未来开发宫颈癌放疗预后预测标志物和潜在治疗靶标提供一定的数据支持和参考。

1、资料与方法

1.1基因表达数据获取

通过GEO数据库(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载宫颈癌组织放疗前后基因表达谱数据GSE6213,其中包括20例放疗前宫颈癌组织和30例放疗1周后的宫颈癌组织。过滤在所有样本中低表达的基因，根据基因表达水平进行标准化和取log2处理，并计算基因表达变异系数(coefficient of variation, CV),过滤CV<10%的基因。

1.2 WGCNA分析识别宫颈癌放疗相关的共表达基因模块

在R中使用软件包“WGCNA”构建无尺度基因共表达网络[12]。检查和确认表达矩阵数据中无缺失值后，首先对样品进行聚类，通过聚类分析将与其他样本差异过大的离群样本删除。根据幂函数曲线选出合适的软阈值以构建出符合无尺度标准的网络。通过计算各基因间的邻接值构建出拓扑重叠矩阵。根据软阈值利用拓扑重叠矩阵(topology overlap matrix, TOM)相似性函数将邻接值转换为具有适当功率值的TOM矩阵，进而将基因分为不同的共表达模块。将所有基因划分为至少包含30个基因的模块，用动态树剪切法将相关性<0.25的模块合并，最终将所有基因划分为数个模块。分别计算每个模块与放疗时机的相关性，挑选出相关性绝对值最大的模块作为放疗相关共表达模块用于进一步分析。并利用Metascape在线分析工具[13],对放疗相关共表达模块内的基因进行功能富集分析，探究潜在生物学功能。

1.3宫颈癌放疗相关共表达模块基因的差异分析

针对WGCNA分析结果中的放疗相关共表达模块，进一步利用差异表达分析探究模块内的基因与放疗的相关性，鉴定放疗前后差异表达的基因。经过上述预处理后的基因表达，根据放疗前后进行分组，使用“limma”分析包中的Bayes算法对数据进行线性模型拟合，计算每个基因在放疗前后的差异表达程度。根据差异表达倍数(FC)和FDR方法校正后P值(|log2FC|>1,FDR<0.1)鉴定差异表达基因，并用箱型图展示差异表达基因的表达量。

1.4宫颈癌放疗相关差异表达基因的生存分析

为了探究放疗差异表达基因的预后预测潜力，利用GEPIA在线分析工具分析宫颈癌组织候选差异基因表达与患者生存预后的关联性[14]。GEPIA工具依托的TGCA数据集收录上百例宫颈癌患者基因表达量和生存预后随访信息。分别将宫颈癌患者按照放疗差异表达基因表达水平平均分为高表达组和低表达组，基于log-rank检验法分析两组间宫颈癌患者总生存时间、无瘤生存时间的差异，并绘制生存曲线(P<0.05为显著相关)。

1.5统计学方法

WGCNA分析和可视化全部基于R软件(4.3.2)的“WGCNA”包，差异表达分析采用“limma”包。生存分析基于GEPIA在线分析工具。功能富集分析基于metascapez在线分析工具。

2、结果

2.1样本聚类与共表达基因模块的构建

GSE6213包含放疗前宫颈癌组织(n=20)和放疗期间宫颈癌组织(n=30)基因表达数据经过log2转换和过滤低变异系数后，共有11 381个基因表达。首先对数据进行样本聚类分析，未识别到样本离群值(见图1a)。然后，基于无尺度拓扑原则，选择6作为合适的软阈值(soft power),在此条件下各基因模块的平均连接度高(见图1b～c)。利用TOM矩阵和动态树法，将基因分为33个模块(见图1d)。

2.2宫颈癌放疗相关共表达模块的识别及功能富集分析

WGCNA算法基于Pearson相关性检验，计算各个基因共表达模块与临床特征的关联性。在所有模块中，共有8个模块与放疗时机存在不同程度相关(P<0.05),其中以“red”模块展示出最强的相关性和显著性(r=-0.5,P=0.000 2)。见图2。

随后，对该模块内的基因进行功能富集分析，可见该模块内的基因显著富集在细胞增殖、凋亡、自噬等过程相关的生物通路，包括RNA代谢通路、高尔基囊体转运、DNA损伤反应、VEGFR2信号通路、DNA复制调控和自噬调控(见图3)。

2.3宫颈癌放疗相关共表达模块内差异基因表达分析

与放疗相关的基因共表达模块内的基因表达改变，可能是标志肿瘤放疗疗效和预后的基因。为此，针对放疗相关共表达模块内的基因进行差异表达分析。模块red中共有514个基因。经过差异表达分析发现，与放疗前相比，2个基因在放疗后呈现显著下调，包括HELZ(log2FC=-1.54,P=0.000 6,FDR=0.06)和NEDD4(log2FC=-1.13,P=0.001 7,FDR=0.08)。见图4a～b。

2.4宫颈癌放疗相关的差异表达基因与宫颈癌预后分析

为了探究放疗差异表达基因与生存预后的相关性，利用GEPIA进行生存分析。结果发现HELZ基因水平高表达的宫颈癌患者总体生存率(Log-rankP=0.034)和无瘤生存率(Log-rankP=0.029)显著下降。NEDD4基因高表达与宫颈癌患者的总生存率下降显著关联(Log-rankP=0.01),与无瘤生存率无显著关联(P>0.05)。即HELZ(见图5a～b)和NEDD4(见图5c～d)的表达维持低水平提示宫颈癌患者的预后良好。

3、讨论

本研究通过基于WGCNA分析宫颈癌放疗前后的基因共表达数据，识别与放疗相关的共表达基因模块。根据模块与放疗之间的相关性、显著性和功能富集分析结果，确定感兴趣的放疗相关共表达基因模块。并针对模块内的基因，通过差异表达分析和生存分析鉴定出放疗前后差异表达基因HELZ和NEDD4与宫颈癌放疗预后相关，可能是宫颈癌放疗疗效和生存预后的预测标志物。这一研究为深入理解宫颈癌放疗机制提供了重要线索，并为寻找潜在的生物标志物和治疗靶点奠定了基础。

图1WGCNA共表达基因模块的构建

a.样本聚类树图：经过样本聚类，未发现有离群样本；b.通过幂函数指数展示不同软阈值的无尺度拓扑程度；c.通过幂函数指数展示不同软阈值的模块连通性；d.确定软阈值为6时基因模块划分树状图。

图2WGCNA模块与放疗的相关性

a.模块与放疗的相关性，其中“red”模块相关性和显著性最强(r=-0.5,P=0.000 2);b.“red”模块内基因表达相关性散点图。每个点表示每个基因与放疗时机相关程度与该模块之间相关性(r=0.42,P=2.4E-23)。

图3放疗相关模块(“red”模块)的功能富集分析

图4HELZ和NEDD4在放疗前后的表达量差异

图5HELZ和NEDD4在宫颈癌患者中的预后分析

a.HELZ高表达与宫颈癌患者总体生存率下降显著关联(Log-rankP=0.034);b.HELZ高表达与宫颈癌患者无瘤生存率下降显著关联(Log-rankP=0.029);c.NEDD4高表达与宫颈癌患者总体生存率下降显著关联(Log-rankP=0.01);d.NEDD4表达量与宫颈癌患者无瘤生存率无显著关联(Log-rankP=0.39)。

WGCNA分析揭示了在宫颈癌与放疗显著相关的共表达基因模块。其中，“red”模块被确定为与放疗高度负相关，其内部基因富集在RNA代谢、DNA损伤反应、DNA复制调控以及自噬调控等通路。既往细胞学研究已表明，放疗通过使细胞增大、空泡化、染色质凝结、核固缩和碎裂等过程来实现抑制、杀灭肿瘤细胞[15-16]。可见，用于放疗的电离辐射会显著影响细胞增殖、代谢、自噬和凋亡等生物过程相关基因的表达，且呈下调趋势(负相关)。

在放疗相关的共表达基因模块中，通过差异表达分析发现HELZ和NEDD4是放疗后显著下调的两个基因。HELZ,即含锌指解旋酶(helicase with Zinc finger),是编码RNA解旋酶的基因之一。RNA解旋酶通过解绕双链区域来改变RNA的构象，从而改变RNA分子的生物活性并调节与其他蛋白质的接触，在细胞增殖、DNA损伤修复等过程中发挥关键作用[17-18]。放疗后HELZ显著下调可能与电离辐射抑制细胞增殖和抑制肿瘤细胞修复DNA损伤有关，是抑制、杀灭肿瘤细胞作用的潜在机制，其表达下调可能是放疗疗效的标志。此外，通过生存分析发现，在HELZ基因高表达的患者群体中总体生存率和无瘤生存率较低表达患者群体显著下降。可见，HELZ表达水平升高与肿瘤复发和不良预后相关，可能是一个诊断和预测宫颈癌复发和预后的潜在标志物。本研究为首次报道HELZ在宫颈癌放疗疗效和预后中的作用。NEDD4(Neural Precursor Cell Expressed, Developmentally Down-Regulated 4, E3)是一个E3泛素连接酶，其编码的蛋白N端为一个钙和磷脂结合的C2结构域，连接富含色氨酸的WW结构域，C端为HECT泛素连接酶催化结构域。NEDD4在调控多种膜受体、内细胞机制成分和肿瘤抑制因子PTEN方面发挥着关键作用，在多种癌症中与细胞存活、细胞增殖、自噬、细胞迁移、侵袭、转移、上皮—间充质转化(EMT)、化疗耐药和多种信号通路[19-20]。许多研究证实NEDD4的过表达促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移[21-23]。在本研究中，NEDD4的下调可能反映放疗对抑制肿瘤细胞增殖的促进作用，而其在宫颈癌患者群体中表达水平升高也与总体死亡率显著相关。因此，HELZ和NEDD4基因的表达水平下降可能是宫颈癌细胞对放疗响应的生物学指标，而其水平升高则是预后不良的标志。

然而，本研究也存在一些限制。首先，该研究基于公共数据库的二次分析，需要进一步的实验验证来确认发现的基因在宫颈癌放疗中的确切作用。其次，样本量相对较小，可能存在一定的选择性偏差。因此，未来的研究应该扩大样本规模，加强对这些基因在宫颈癌放疗中的功能验证。

总体而言，本研究通过WGCNA分析和生存分析揭示了放疗相关的共表达基因模块，并鉴定了HELZ和NEDD4作为宫颈癌放疗预后的潜在生物标志物。这些结果为深入理解宫颈癌放疗机制、发现新的治疗靶点和制定个体化治疗方案提供了有益的信息。未来的研究应该进一步验证这些发现，并深入探讨这些基因在宫颈癌放疗中的分子机制。

参考文献:

[3]周晖,刘昀昀,罗铭,等.《2023 NCCN子宫颈癌临床实践指南(第1版)》解读[J].中国实用妇科与产科杂志,2023,39(2):189-196.

文章来源:黄晗,司小三,崔贺凯,等.基于WGCNA分析鉴定宫颈癌放疗预后相关基因[J].医学理论与实践,2024,37(19):3268-3272.