口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是一种来源于口腔颌面部鳞状上皮，发生率较高的恶性肿瘤[1]。随着医疗技术的不断进步，口腔癌的治疗手段和技术得到了逐步革新。但由于原位复发、易早期发生区域淋巴结转移等原因[2-3],口腔癌依旧有着较高的患病率和死亡率[4-5]。目前OSCC的治疗方案多采用以手术为主，放化疗为辅的综合序列疗法[6]。辅助化疗对于缩小肿瘤，预防和治疗远处转移有着重要的价值，随着化学药物的广泛使用，耐药的问题也随之出现[7],化疗耐药是化学治疗面临的主要挑战[8-9],也是口腔癌预后无明显改善的主要原因之一，是口腔癌临床治疗亟待解决的关键问题。

作为抗肿瘤药物的主要来源之一，中药在恶性肿瘤治疗中的价值日益凸显。大黄素是一种主要存在于大黄根茎中的天然活性化合物，其已被证实有消炎、抗菌和抗肿瘤等作用[10],具有靶向肿瘤致癌过程的显著潜力[11],且已被证明在结肠癌、肝癌和胰腺癌中具有抗肿瘤的作用[12]。但大黄素对于OSCC是否具有抗癌作用近年来报道较少。

自噬是主要依赖于溶酶体一种细胞降解途径，其在多种疾病的发生机制中发挥重要作用[13]。已有研究证实，在恶性肿瘤的发生及转归中，自噬可发挥抑制肿瘤发生但支持肿瘤进展的双重作用，其也被证实在OSCC中，可调节肿瘤生长[14]。自噬可能是恶性肿瘤治疗研究中的一种新方向[15]。

本课题研究对象选用人OSCC细胞，用不同浓度大黄素处理并加入自噬激活剂雷帕霉素(rapamycin, RAPA)进行干预，检测CAL-27增殖及自噬等指标，探究大黄素对OSCC细胞的增殖及自噬的影响。

1、材料与方法

1.1实验材料

人OSCC细胞系CAL-27(湖南丰晖，中国);人OSCC细胞系SCC-15(湖南丰晖，中国);大黄素(上海源叶，中国);雷帕霉素(麦克林，中国);DEME高糖培养基、胎牛血清、双抗、胰蛋白酶(Hyclone,美国);RIPA蛋白裂解液、PMSF、上样缓冲液、电化学发光液(碧云天，中国);DMSO(索莱宝，中国);CCK-8检测试剂盒(碧云天，中国);β-actin、Beclin1、PCNA、LC3抗体(博士德，中国);酶标仪RT-6100(雷杜，中国);蛋白印迹系统(ChemiDoc XRS+,BIO-RAD,美国);4%多聚甲醛通用型组织固定液(biosharp,中国);瑞氏-姬姆萨染液(biosharp,中国);羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗(中衫金桥，中国)。

1.2细胞培养

将CAL-27细胞及SCC-15细胞置于含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM高糖培养基，37℃、体积分数5% CO2及饱和湿度条件下培养，当细胞长至80%～90%融合时，用胰酶消化传代1次。取对数生长期细胞进行实验。

1.3细胞增殖活力测定

当CAL-27细胞及SCC-15细胞培养至对数生长期时，将其消化后以每孔8×103个细胞接种于96孔板中，分为5组，待细胞融合度达到70%,分别使用浓度为0、50、100、150、200μmol/L的大黄素进行处理，每组各设5个复孔。分别在大黄素处理24 h、48 h、72 h后，于每孔加入90μL DMEM高糖培养基、10μL CCK-8,在培养箱中培养1 h后，使用酶标仪在450 nm处测量光密度(OD)值并计算各组细胞增殖抑制率，计算出大黄素对细胞的24 h半数抑制浓度(IC50),选择细胞系用于后续实验。在检测自噬对细胞增殖活性的影响时，增加雷帕霉素组(25 nmol/L),雷帕霉素(25 nmol/L)联合大黄素组(IC50),处理细胞24 h后，按以上方法测量光密度值并计算细胞活力。

1.4集落形成实验

将对数生长期的OSCC细胞消化后接种于6孔板中，每孔3×105个细胞，待细胞融合至70%,分别使用浓度为0、100、150、200μmol/L的大黄素进行处理。在检测自噬对集落形成的影响时，增加雷帕霉素组(25 nmol/L),雷帕霉素(25 nmol/L)联合大黄素组(IC50),处理24 h后，分别消化每组细胞，再次接种于6孔板中，每孔1 000个细胞，培养10～14 d后，采用多聚甲醛将其固定并采用瑞氏-姬姆萨染液进行染色。

1.5 Western blot分析

将对数生长期的OSCC细胞消化后接种于6孔板中，每孔3×105个细胞，待细胞融合至70%,分别使用浓度为0、100、150、200μmol/L的大黄素进行处理。在检测自噬对增殖相关蛋白指标表达的影响时增加雷帕霉素组(25 nmol/L),雷帕霉素(25 nmol/L)联合大黄素组(IC50),培养24 h后，每孔加入100μL裂解液，在冰上分别提取各组细胞总蛋白，测定总蛋白浓度后将其煮沸变性。制取分离胶及浓缩胶，取变性蛋白样品上样，电泳，转膜，脱脂奶粉封闭2 h,分别加入一抗(β-actin, 1∶5 000稀释；PCNA,1∶1 000稀释；Beclin1,1∶1 000稀释；LC3,1∶500稀释),孵育过夜，TBST洗膜，二抗(β-actin、Beclin1、LC3使用羊抗兔二抗，1∶5 000稀释；PCNA使用羊抗鼠二抗，1∶5 000稀释)室温孵育2 h, TBST洗膜，进行ECL检测发光显影，获取图像，通过Image J对蛋白的表达量进行半定量分析。

1.6 OSCC裸鼠皮下移植瘤模型的建立

选用10只5周龄SPF级雄性BALB/c裸鼠(维通利华，北京)[审查批号湖北医药学院动(福)第2022-131号],饲养于湖北医药学院附属人民医院实验动物中心。取对数生长期的OSCC细胞按1×107个/mL的密度，0.2 mL接种于裸鼠左侧腋下。

1.7实验分组及用药

待移植瘤体积达到约60 mm3时，将10只裸鼠随机分成2组，腹腔注射DMSO浓度<0.1%的生理盐水或40 mg/kg的大黄素，1次/3 d,连续给药8次，每3 d测量一次肿瘤大小，测量肿瘤最大径(la)和与之相垂直的横径(lb),肿瘤体积按照公式V(mm3)=la×lb2÷2计算，绘制肿瘤生长曲线。停药7 d后处死裸鼠，剥离肿瘤，测得肿瘤质量。

1.8 HE染色

裸鼠处死后，取出的裸鼠的肝、肾组织在常温下以4%的多聚甲醛溶液固定24 h,包埋石蜡，切片，进行HE染色，光镜下观察肝、肾等重要器官结构变化。

1.9免疫组化

裸鼠处死后，取出的裸鼠的肿瘤组织在常温下以4%的多聚甲醛溶液固定24 h,石蜡包埋后，组织石蜡切片常规脱蜡水化后，封闭后，分别孵育Beclin1(1∶100)、PCNA(1∶100),4℃过夜后，Beclin1加羊抗兔二抗，PCNA加羊抗鼠二抗，37℃孵育30 min, DAB显色，光镜下观察细胞染色情况。

根据5个200倍随机视野下PCNA及Beclin1阳性细胞比例评定蛋白表达情况。PCNA显示细胞核阳性，Beclin1显示细胞质阳性。根据阳性细胞所占百分比打分，阳性细胞(细胞内有黄色或黄棕褐色颗粒)<5%、5%～25%、25%～50%、50%～75%、>75%分别对应0、1、2、3、4分。

1.10统计学分析

数据分析采用SPSS 22.0统计软件，计量资料采用表示，两独立样本间采用t检验分析样本之间的差异，多组比较采用单因素方差分析，多组间的两两比较采用Tukey检验；P<0.05为差异有统计学意义。

2、结 果

2.1大黄素抑制OSCC细胞的增殖

根据CCK-8实验，在CAL-27、SCC-15两组细胞系中，相同时间段内，50、100、150、200μmol/L大黄素处理组的细胞存活率均显著低于对照组。随大黄素浓度的升高及时间的延长，细胞存活率呈现下降趋势。可见大黄素能抑制CAL-27细胞、SCC-15细胞的增殖活力，且有浓度依赖性，随着时间的延长，活力也逐渐降低，其中CAL-27细胞24 h、48 h、72 h的半数抑制浓度(IC50)分别是168.4、113.0、97.2μmol/L(图1A);SCC-15细胞24 h、48 h、72 h的半数抑制浓度(IC50)分别是315.2、137.2、116.5μmol/L(图1B)。

图1大黄素抑制OSCC细胞的增殖能力

Fig.1Emodin inhibits the proliferative ability of OSCC cells

A: CCK-8检测不同浓度的大黄素对CAL-27细胞增殖活力的抑制作用；B:CCK-8检测不同浓度的大黄素对SCC-15细胞增殖活力的抑制作用。*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001,****:P<0.000 1。

2.2大黄素对CAL-27细胞集落形成及增殖能力的影响

根据CCK-8实验，选择CAL-27细胞系进行后续实验，集落形成实验中，与对照组相比，随着大黄素浓度的增加，细胞所形成的集落数逐渐减少(图2A、B)。Western blot结果显示，PCNA蛋白相对表达量随着大黄素浓度的升高而减少(图2C、D)。提示大黄素可抑制CAL-27细胞的增殖。

2.3大黄素抑制CAL-27细胞的自噬

通过Western blot检测LC3、Beclin1的表达。不同浓度的大黄素处理CAL-27细胞24 h后，100、150、200μmol/L大黄素处理组的CAL-27的自噬相关指标Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的蛋白表达量均低于对照组，且随大黄素浓度的升高，表达量越低(图3A～C)。大黄素表现出对CAL-27细胞自噬的抑制作用且随浓度的升高而增强。

2.4 RAPA可逆转大黄素对CAL-27细胞的增殖抑制作用

根据CCK-8实验，选择150μmol/L作为处理24 h的IC50进行逆转实验。分为对照组、RAPA处理组、大黄素处理组、RAPA+大黄素处理组。与单纯大黄素处理组相比，大黄素联合RAPA干预细胞24 h后，CAL-27细胞增殖活性出现一定升高(图4A),集落形成实验显示细胞集落形成数量明显上升(图4B、C)。RAPA表现出对大黄素抑制CAL-27细胞增殖的逆转作用。

图2大黄素对CAL-27细胞集落形成及增殖能力的影响

2.5增强自噬可逆转大黄素对CAL-27细胞的增殖抑制作用

Western blot结果显示在RAPA与大黄素联合干预后，与单纯大黄素处理相比，PCNA、Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的蛋白表达量呈现上升趋势(图5A～D)。RAPA与大黄素联合干预可逆转大黄素对CAL-27细胞自噬及增殖的抑制作用。

图3大黄素抑制CAL-27细胞的自噬

2.6大黄素在体内抑制OSCC移植瘤的生长和自噬

在体内研究中，大黄素处理组的裸鼠移植瘤体积及质量均低于对照组。采用BALB/c裸鼠皮下注射CAL-27细胞结果表明，大黄素处理可以抑制裸鼠移植瘤的肿瘤体积和质量的增加(图6A～C)。

各组裸鼠处死后取肝、肾等组织进行HE染色，在光镜下观察可见，大黄素组及对照组的裸鼠肝、肾组织均结构完整，无明显病理改变，未见转移瘤(图7)。

免疫组化结果显示PCNA、Beclin1在对照组中细胞中均呈现高表达，经大黄素用药后，与对照组比较，大黄素组的肿瘤组织中PCNA、Beclin1阳性细胞均明显减少(图8A～C)。此外，大黄素组肿瘤组织中PCNA和Beclin1的表达表现出一定的正相关(R2=0.465 9,P=0.005 1)(图8D、E)。

图4 RAPA逆转大黄素对CAL-27细胞的增殖抑制作用

图5增强自噬可逆转大黄素对CAL-27细胞的增殖抑制作用

图6给药后荷瘤裸鼠的肿瘤体积变化和肿瘤质量

图7各组裸鼠肝、肾组织无明显病理改变，未见转移瘤

图8大黄素对Beclin1、PCNA免疫组化表达量的影响及Beclin1、PCNA的相关性

3、讨 论

OSCC是来源于口腔鳞状上皮的恶性肿瘤，易复发，易早期发生远处转移，对机体危害大，发病机制复杂[16-18]。针对口腔癌的治疗，目前临床广泛采用根治性手术结合辅助放化疗的综合序列疗法，但患者的远期生存率目前仍不理想[19]。所以进一步探索OSCC发病机制，筛选新的药物靶点，研发新的抗癌药物等对于改善OSCC的预后有着积极的意义。

目前，传统中药成分的抗肿瘤性能日益得到关注，其还具备细胞毒性相对较低，对患者造成的经济负担较小等诸多优势。大黄素是一种来源于中药大黄的蒽醌类天然化合物，已有研究证实，大黄素可在多种恶性肿瘤中发挥抗癌作用，其可抑制肝癌、甲状腺乳头状癌等癌细胞的增殖能力等[20-22]。虽然已有较多研究证实大黄素对多种实体瘤可发挥抗癌作用，但其对OSCC的抗肿瘤作用目前相关的报道仍较少。基于此，本研究通过体外及体内实验对大黄素对口腔癌的抗癌作用进行探索。

在本研究中，首先通过CCK-8实验筛选出大黄素的浓度范围，并进一步通过CCK-8和集落形成实验发现，大黄素可以明显抑制CAL-27细胞的增殖活力和集落形成能力，且具有良好浓度依赖性。这说明适宜浓度的大黄素可以抑制口腔癌细胞的增殖。后续，我们对其抑制增殖的机制进行了进一步探索。

自噬是细胞在代谢过程中更新变异蛋白、降解衰老细胞器的过程。细胞自噬在其生长过程中发挥“双刃剑”的作用，正常生理状态下，自噬通过提升细胞的增殖能力或抑制增殖，维持发育及代谢的平衡[23]。但在炎症、肿瘤等病变状态下，自噬会发生失调，自噬不足或过度自噬均可导致细胞损伤进而影响疾病的发生、发展与转归。基于此，本研究拟探索大黄素对OSCC的抗癌作用与自噬之间的关系。

LC3是特异的自噬检测指标，目前被大量研究作为自噬标志性物质，Beclin1的表达量下调同样可作为自噬受抑制的检测标准[24]。本研究采用大黄素处理CAL-27细胞后，细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1随大黄素浓度升高显著下调，证明细胞自噬受到抑制。由此我们推测大黄素抑制OSCC细胞增殖可能与其下调了LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1的表达有关，其可能通过抑制自噬来抑制CAL-27细胞增殖。

为了进一步验证大黄素抑制CAL-27增殖的机制，研究利用RAPA作为自噬激活剂用于后续的机制研究。本研究采用RAPA联合大黄素共处理CAL-27细胞，CCK-8和集落形成实验结果显示，相较于大黄素处理组，RAPA可一定程度逆转大黄素对增殖的抑制作用。在RAPA及大黄素的联合干预下，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、PCNA的表达量也呈现逆转趋势。因此，大黄素可能通过抑制自噬来抑制CAL-27的增殖。在体内实验中，大黄素对裸鼠成瘤也表现出良好的抑制作用，且在新生肿瘤中Beclin1、PCNA的表达量也呈下降趋势，说明在体内环境下，大黄素亦可抑制自噬和增殖，这与细胞实验的相关结果是一致的。此外，裸鼠在腹腔给予相应剂量的大黄素后，未表现出明显的肝、肾毒性。这也进一步证实其无明显的细胞毒性。

本课题通过体外和体内实验证实了大黄素可能通过调节自噬抑制CAL-27细胞的增殖，但其具体的分子作用机制尚待研究。基于以上研究结果来看，大黄素在口腔癌治疗方面具有一定的潜力，然而，目前相关的研究仍较少，未来仍需要更进一步的研究来揭示大黄素的抗癌性能及机制，为其实现临床应用提供证据。

基金资助:十堰市科技局项目(21Y51);湖北省教育厅科研项目(B2022133);湖北医药学院研究生科技创新项目(YC2022052);

文章来源:熊轲,张昊,胡图强.大黄素通过调节自噬抑制口腔鳞状细胞癌细胞的增殖[J].口腔医学,2024,44(08):602-608.