肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)占人类恶性肿瘤的2%～3%,肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)是RCC最常见组织学类型之一，发现时多为晚期，对放化疗不敏感，晚期患者中位5年生存率<10%[1]。晚期ccRCC多采用靶向和免疫治疗，靶向治疗费用昂贵，且易产生耐药性。免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors, ICIs)包括针对抑制程序性死亡受体-1(programmed death-1,PD-1)、程序性死亡受体配体-1(programmed death-ligand 1,PD-L1)和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4,CTLA-4)的药物，联合靶向治疗是晚期ccRCC新一线治疗方案，与单独应用靶向药物相比，患者总生存期(overall survival, OS)延长[2-4]。但ICIs对不同肿瘤治疗效果大相径庭，易产生耐药，且有不良反应。乳酸脱氢酶D(lactate dehydrogenase D,LDHD)属于D-异构体特异性2-羟基酸脱氢酶家族，由位于16q22.3的LDHD基因编码，参与丙酮酸、蛋白质代谢和线粒体蛋白输入。越来越多证据表明LDHD在多种肿瘤进展和免疫治疗中发挥重要作用[5-7],但在泌尿系统肿瘤中的研究有限。本研究通过免疫组织化学检测LDHD在ccRCC组织中的表达，分析LDHD与各临床病理特征的关系。采用肿瘤免疫估计资源(tumor immune estimation resource, TIMER)和基于基因表达水平值的交互式分析平台(gene expression profiling interactive analysis, GEPIA)数据库分析LDHD与免疫检查点(immune checkpoints, ICPs)和免疫细胞浸润的关系，期望为ccRCC治疗策略选择提供依据。

1、材料与方法

1.1 标本来源

收集2011-01-01-2018-12-31滨州医学院附属医院术后诊断为ccRCC的71例患者临床资料及组织标本，癌旁2 cm正常肾组织作为对照。71例患者中男42例，女29例；年龄21～78岁，中位年龄59岁；肿瘤最大径1～15 cm, 平均最大径(5.33±3.06) cm。纳入标准：一般情况良好，术前未行任何治疗；临床病理及随访资料完整。排除标准：慢性肾病、肾脏衰竭病史；其他恶性肿瘤病史。本研究经滨州医学院附属医院伦理委员会批准和审核(2022年第32号),患者知情同意。

1.2 随访

对纳入的71例ccRCC患者采用电话随访疾病进展情况，随访时间为确诊ccRCC至患者死亡或随访结束(2022-12-31)。中位随访时间83个月(12～132个月),无失访患者。

1.3 生物信息学分析

1.3.1 TIMER数据库

TIMER数据库采用高通量测序系统分析基因在不同癌症中免疫细胞浸润情况[8]。本研究分析533例ccRCC患者LDHD表达水平与免疫细胞浸润和ICPs表达水平的相关性。

1.3.2 GEPIA数据库

GEPIA数据库可提供交互分析的网络工具[9],借助来源于TCGA数据库中523例ccRCC癌组织和GTEx数据库72例正常肾组织样本分析LDHD表达与ICPs表达水平的相关性。

1.4 免疫组织化学检测

石蜡组织4 μm连续切片，EDTA溶液高压修复；3% H2O2溶液37℃孵育15 min; LDHD一抗(武汉三鹰有限公司，1∶400)4 ℃孵育过夜。次日复温水洗，PBS浸泡；生物素标记的羊抗兔IgG室温孵育30 min, 水洗，PBS浸泡；DAB显色；苏木精复染；梯度乙醇脱水；中性树胶封片扫片。

1.5 结果判定标准

LDHD表达于细胞质，采用乘积法进行判读，阳性细胞占比分为0分(无细胞着色)、1分(≤25%)、2分(>25%～50%)、3分(>50%～75%)和4分(>75%)。染色强度分为0分(无着色)、1分(淡黄色)、2分(棕黄色)和3分(棕褐色)。最终评分0分为阴性，1～4分为低表达，5～8分为中表达，9～12分为强表达[10]。

1.6 统计学方法

采用SPSS 26.0对数据进行统计分析，采用秩和检验分析LDHD在ccRCC癌组织和癌旁正常肾组织中表达情况，χ2检验和Fisher精确检验分析LDHD与ccRCC临床病理变量的关系，Cox回归分析筛选ccRCC预后影响因素，生存分析采用Kaplan-Meier。TIMER数据库采用Spearman相关系数检验分析LDHD与ICPs、免疫细胞浸润的关系，GEPIA数据库采用Pearson相关系数检验分析LDHD与ICPs的关系。检验水准α=0.05(双尾)。

2、结果

2.1 癌组织和癌旁正常组织LDHD表达

癌旁正常肾组织中，LDHD评分9～12分占100%(71/71)。肾小球组织不表达LDHD,在近曲小管、髓袢(近直小管、细段、远直小管)、远曲小管和集合管组织强表达呈递减趋势。仅统计可识别出的肾脏正常组织不同区域中LDHD表达情况，ccRCC癌组织评分0分占32.39%(23/71),1～4分占67.61%(48/71),其中1分占53.52%(38/71),2分占14.09%(10/71)。ccRCC癌组织中LDHD表达水平低于癌旁正常肾组织，t=-11.27,P<0.001。见表1、图1和图2。

表1癌组织和癌旁正常组织LDHD表达评分[n(%)]

图1肾透明细胞癌癌旁正常肾组织LDHD阳性表达(EnVision染色，×200)

2.2 LDHD阳性表达与ccRCC患者临床特征关系

不同肿瘤最大径、国际泌尿病理学会(International Society of Urological Pathology, ISUP)分级和T分期患者LDHD表达差异有统计学意义，均P<0.05。生存分析结果显示，不同结局ccRCC患者LDHD表达水平差异有统计学意义，P=0.016。见表2。

2.3 ccRCC患者预后影响因素

Kaplan-Meier分析显示LDHD阴性ccRCC患者生存率低于LDHD阳性患者(56.52%vs89.58%,χ2=10.890,P<0.001)。LDHD阴性ccRCC患者总生存时间低于LDHD阳性患者(85.7个月vs122.5个月，P<0.001)。见图3。

单因素Cox回归分析显示，年龄、肿瘤最大径、ISUP分级、LDHD表达是ccRCC患者预后关联因素，均P<0.05。将T分期及单因素分析有意义的变量纳入多因素Cox回归分析，结果显示肿瘤最大径、T分期、ISUP分级和LDHD的表达均可作为ccRCC患者预后的独立预测指标，均P<0.05。见表3。

图2肾透明细胞癌组织LDHD阳性表达(EnVision染色)

表2ccRCC患者中LDHD表达与临床病理特征关系(n)

2.4 LDHD与ICPs关系

TIMER数据库Spearman相关系数检验显示，LDHD转录本每百万读数(transcripts per kilobase million, TPM)的对数与PD-1的TPM对数(rs=-0.220,P<0.001)和CTLA-4的TPM对数(rs=-0.253,P<0.001)呈负相关，与PD-L1的TPM对数(rs=0.205,P<0.001)呈正相关。GEPIA数据库Pearson相关系数检验显示，LDHD的TPM对数与PD-1的TPM对数(r=-0.180,P<0.001)和CTLA-4的TPM对数(r=-0.260,P<0.001)存在负相关，与PD-L1的TPM对数(r=-0.039,P=0.340)无关。见图4。

图3肾透明细胞癌患者生存率

注：ISUP.国际泌尿病理学会；ISUP分级采用2016年分级标准；参照2017年美国癌症联合委员会第8版肾脏肿瘤的诊断标准进行T分期；LDHD.乳酸脱氢酶D;ccRCC.肾透明细胞癌。

表3影响ccRCC患者预后的单因素和多因素Cox回归分析

图4TIMER和GEPIA数据库中ccRCC患者LDHD表达与ICPs的关系

2.5 LDHD表达与免疫细胞浸润的关系

利用TIMER数据库Spearman相关系数检验显示，LDHD的TPM对数与肿瘤纯度呈正相关(rs=0.242,P<0.001),与B细胞(rs=-0.120,P=0.010)、CD4+T细胞(rs=-0.143,P=0.002)、CD8+T细胞(rs=-0.131,P=0.006)、巨噬细胞(rs=-0.101,P=0.033)、中性粒细胞(rs=-0.155,P<0.001)和树突状细胞(rs=-0.158,P<0.001)浸润水平呈负相关，提示LDHD低表达的ccRCC患者免疫细胞浸润程度更高。见图5。

3、讨论

糖酵解激活是恶性肿瘤的重要特征，LDH在糖酵解中发挥重要作用。D-乳酸可通过乙二醛酶途径产生，经过一系列的酶促反应，乙二醛被转化为D-乳酸，D-乳酸在LDHD作用下转化为丙酮酸，乳酸在代谢重编程和免疫逃逸中起重要作用[11]。LDHD广泛存在人体组织中，以肾脏含量最高。本研究结果显示，LDHD在癌旁正常肾组织不同结构表达情况存在差异，在肾小球中不表达，在近曲小管、髓袢(近直小管、细段、远直小管)、远曲小管和集合管均有表达。

de Bari等[12]首次证实LDHD在人类前列腺癌细胞中表达。既往研究表明LDHD在子宫肉瘤中高表达[10],在乳腺癌、胆管癌和肺腺癌中低表达[5-7],在食管鳞状细胞癌肿瘤干细胞中富集[13]。本研究表明在ccRCC中LDHD表达降低。LDHD在胆管癌、乳腺癌和食管鳞状细胞癌中表达情况与患者预后相关[5-6,13],LDHD表达降低与乳腺癌的风险增加相关[6]。Wang等[14]研究发现，LDHD在ccRCC中低表达，低表达患者总生存期低于高表达患者，LDHD是ccRCC患者的独立预后标志物，且提示LDHD表达与T分期密切相关。本研究显示，LDHD表达水平在ccRCC患者中肿瘤最大径≤4 cm者高于>4 cm者，T1～T2期者高于T3～T4期者，WHO/ISUP分级1～2级者高于3～4级者，随着ccRCC疾病进展LDHD表达降低，且LDHD表达与肿瘤最大径、ISUP分级、患者预后相关，可作为ccRCC独立预后因素。这些发现提示LDHD下调可能是导致ccRCC发病、进展和不良预后的重要因素。

图5ccRCC患者LDHD表达与免疫细胞浸润的关系

在乳腺癌中包含LDHD在内的12个乳酸代谢相关基因与免疫应答相关，LDHD表达水平与PD-L1和CTLA4表达呈负相关[6]。在胆管癌中，LDHD与免疫细胞浸润相关[5]。本研究显示，LDHD的TPM对数与B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞浸润水平呈负相关。肿瘤浸润性B淋巴细胞作为肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)的重要组成部分，存在于RCC的各个阶段，具有提呈肿瘤抗原、调节免疫力的作用，在肿瘤的形成和发展中发挥重要作用[15]。在ccRCC中，T细胞占比高于其他组织类型RCC[16],CD8+T细胞水平高于癌旁组织[17]。CD4+T细胞和CD8+T细胞可通过靶向肿瘤细胞来抑制肿瘤生长，ccRCC肿瘤组织的抗原可激活CD8+T细胞分泌组织蛋白酶C、穿孔素和颗粒素融合靶细胞膜，提高靶细胞杀伤能力[18]。Giraldo等[19]发现ccRCC肿瘤浸润缘的CD8+T细胞密度与ISUP分级相关。大量活化的CD8+T细胞与肿瘤的良好预后相关，但与ccRCC预后的关系尚存争议[20-21]。M1型巨噬细胞可激活肿瘤免疫反应，发挥肿瘤杀伤作用，M2型巨噬细胞帮助免疫细胞逃避免疫监视[22]。单核/巨噬细胞的高浸润促进ccRCC肿瘤细胞的免疫逃逸[23]。在肿瘤中，中性粒细胞可以通过促进肿瘤血管生成、细胞外基质重塑和免疫抑制来促进炎症，也可以通过直接杀死肿瘤细胞、介导抗肿瘤耐药性细胞网络发挥抗肿瘤反应[24]。ccRCC中中性粒细胞PD-1、PD-L1和CTLA-4低表达甚至无表达，这为ccRCC免疫治疗耐药提供了新方向[25]。树突状细胞是抗肿瘤T细胞免疫应答的支点，通过调节活性、呈递肿瘤相关抗原，间接促进T细胞反应[26]。此外，本研究结果显示低LDHD表达组免疫细胞的浸润更丰富，提示可能对免疫治疗更敏感。

在ccRCC中，LDHD与PD-1呈负相关，LDHD在ccRCC中表达降低，PD-1表达增高，抑制调节T细胞，介导免疫逃逸。Granier等[27]分离CD8+T淋巴细胞表面的PD-1,发现PD-1阳性表达与ccRCC更高的分级和TNM分期相关。PD-L1高表达的ccRCC患者预后更好[28]。Han等[29]发现ccRCC中CTLA4表达与肿瘤内纤维化水平呈负相关。TIMER数据库分析表明LDHD的TPM对数与PD-1和CTLA-4的TPM对数呈负相关，与PD-L1的TPM对数呈正相关，GEPIA数据库分析结果略有差异，显示LDHD的TPM对数与PD-L1的TPM对数无关，提示靶向LDHD可以提高ccRCC免疫治疗的疗效，通过使用PD-1、PD-L1或CTLA-4抑制剂增强免疫系统可改善ccRCC患者的生活质量和预期寿命[19,30]。

综上所述，本研究发现LDHD蛋白在肾小球不表达，在近曲小管、髓袢(近直小管、细段、远直小管)、远曲小管和集合管表达。与癌旁正常肾组织相比，ccRCC中LDHD表达下调，且表达水平与不良预后相关。LDHD表达水平与ccRCC的肿瘤最大径、分期、WHO/ISUP分级有关。LDHD的TPM对数与ICPS(PD-1、CTLA-4)TPM对数呈负相关，LDHD可能介导了ccRCC的肿瘤免疫逃逸。LDHD的TPM对数与B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞呈负相关，为探索ccRCC潜在免疫治疗靶点及生物学标志物提供了参考。

参考文献:

[3]李长岭,齐隽,陈立军,等.晚期肾透明细胞癌一线靶向治疗的优化选择中国专家共识(2022)[J].临床泌尿外科杂志,2022,37(5):329-337.

基金资助:山东省自然科学基金(ZR2020MC068);

文章来源:公海凤,张冰,赵大华,等.肾透明细胞癌中乳酸脱氢酶D表达及其临床意义[J].中华肿瘤防治杂志,2024,31(18):1116-1123.