经口腔黏膜免疫作为一种前景广阔的微创疫苗作用方式，经口腔黏膜施用疫苗相对安全、易于操作，同时可以诱导先天性和适应性免疫反应，并在效应部位诱导IgG1和IgG2b分泌，尤其是唾液分泌型IgA的产生，从而阻断局部和全身感染[1]。唾液分泌型IgA是龋病免疫预防中发挥主要作用的抗体[2],黏膜免疫难以诱导，通常需要使用免疫佐剂突破黏膜免疫耐受实现免疫放大作用[3,4]。FimH是Toll样受体4(Toll-like receptor 4, TLR4)的一种新的病原相关模式分子，可以直接与抗原提呈细胞上的TLR4结合，从而诱导强效的免疫反应[5,6]。本课题组前期研究中构建并原核表达了鼠伤寒沙门氏菌的FimH(FimH-S.typhimurium, FimH-ST)蛋白，将FimH-ST作为黏膜佐剂用于增强防龋疫苗免疫效应。研究结果证明FimH-ST蛋白可以提高大鼠特异性抗Pac血清IgG和唾液sIgA抗体水平，实现大鼠龋齿保护效应[7,8],FimH通过与树突状细胞(dendritic cells, DCs)表面的TLR4结合，促进DCs活化，继而增强防龋疫苗的免疫效应[6,9]。但是FimH活化DCs的具体分子机制尚待深入研究，评价黏膜免疫佐剂的免疫增强效应并探索其相关作用机制对于研发新型高效的黏膜免疫佐剂具有重要的指导意义。

肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1),又称STK11(serine/threonine kinase 11),是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。近来，LKB1通过DCs在肿瘤、心血管和代谢疾病中的病理生理作用备受关注，研究提示LKB1控制细胞代谢的信号通路调控DCs的功能，限制DCs迁移，促进DCs表面CD86、OX40L表达和IL-6分泌以调控T细胞反应以维持免疫静止[10,11,12]。有意义的是，DCs表达LKB1不影响DCs的发育及炎症分子表达[10,11]。Zhang等[13]利用慢病毒转导法修饰DCs上LKB1的表达，发现DCs上LKB1的表达不影响DCs的抗原摄取能力，但是促进了T细胞的增殖，并且LKB1抑制共刺激分子OX40L和CD86的表达，下调免疫抑制分子IL-10。在系统免疫反应过程中LKB1被认定为DCs控制T细胞稳态、免疫反应和免疫耐受的开关[10,13]。DCs是黏膜免疫反应中抗原提呈功能最强的免疫细胞，决定黏膜免疫反应的强度和类型。黏膜免疫反应和系统免疫反应具有差异性，但尚未有研究涉及关于LKB1对黏膜DCs的影响，如LKB1是否参与调控DCs在黏膜疫苗免疫中的效应，以及LKB1是否影响DCs对FimH黏膜佐剂的效应。

FimH通过识别DCs表面的TLR4增强防龋疫苗的黏膜免疫效果，而LKB1与DCs的免疫调控功能相关，这提示LKB1可能会影响DCs在疫苗或佐剂黏膜免疫应答过程中的调节作用，潜在的分子机制可能与黏膜佐剂发挥效应相关。因此，本研究采用CD11ccre-GFP;LKB1fl/fl的DCs条件性LKB1缺陷小鼠，通过流式细胞术分选口腔黏膜DCs, 利用转录组测序探究LKB1对稳态下口腔黏膜DCs的影响。随后以卵清蛋白(ovalbumin, OVA)作为模式抗原、FimH-ST作为佐剂，经口腔颊黏膜疫苗免疫动物，探究LKB1对口腔黏膜DCs对黏膜佐剂FimH-ST免疫增强效应的影响，以初步探讨DCs调节FimH-ST佐剂效应的可能机制。

1、材料与方法

1.1 材料和试剂

OVA(Sigma, 美国);FimH-ST如前制备[7,8];磷酸盐缓冲液(phosphate buffer, PBS, Hyclone, 美国);0.2%硝酸毛果芸香碱(真瑞，中国);微量RNA提取试剂盒(Invitrogen, 美国);牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA,德国Roche);生物素耦联的小鼠IgG2b抗体(BD,美国);生物素耦联的小鼠IgG1抗体(BD,美国);链酶亲和素-辣根过氧化物酶(BD,美国);3,3',5,5-四甲基联苯胺显色液(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine, TMB, Solarbio, 中国);Fixation/Permeabilization试剂盒(BD,美国);70 μm细胞过滤器(Biologix, 美国);96孔聚苯乙烯微量酶标板(Corning Costar, 美国);Ⅳ型胶原酶(Gibco, 美国);新生牛血清(四季青，中国);以下流式细胞术抗体购自美国BD:Fc受体阻断剂、Biotin/CD3、APC/CD4、BV510/CD8、BV510/CD4、PerCP-cy 5.5/CD62L、BV421/CD138、BV421/RoRγt、PE/CD326;以下流式细胞术抗体购自美国invitrogen: PE/IL-4、PerCP-eFluor 710/IL-17、eFluor 450/INF-γ、PE/Foxp3、PerCP-eFluor 710/Gata3、APC/T-bet、APC-eFluor 780 /CD4、APC-eFluor 780/CD45、PE/cy.7/PD-1、APC/CXCR5、APC-eFluor 780/B220、APC/CD19、PE/cy.7/IgD;以下流式细胞术抗体购自美国Biolegend: BV650/CD8、BV510/CD44、SA-BV421。LSRFortessa多维高清流式细胞分析仪(BD,美国);Aria Ⅱ分选型流式细胞仪(BD,美国);ELX 型酶标阅读仪(Bio-tek, 美国)。

1.2 实验动物

本研究经过武汉大学生物医学伦理委员会实验动物福利伦理分会批准(批准号：2016-72),全程严格遵循动物伦理原则。携带LKB1等位基因(LKB1fl/fl)和DCs表达CD11ccre-GFP的小鼠购自Jackson Laboratory, 库存号分别为014143和007567,品系名分别为STOCK Stk11tm1.1Sjm/J和C57BL/6J-Tg(Itgax-cre, -EGFP)4097Ach/J,遗传背景均为C57BL/6J。我们将CD11ccre-GFP小鼠和LKB1fl/fl小鼠杂交，繁育基因型为CD11ccre-GFP;LKB1fl/fl的DCs条件性敲除LKB1小鼠(conditional knockout, cKO),同窝LKB1fl/fl基因型作为野生型(wild type, WT)非基因缺陷对照组。设计6～8周龄小鼠颊黏膜下局部注射疫苗实验。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型建立

选6～8周龄雌性cKO与WT小鼠各10只，分为4组：OVA模式抗原口腔黏膜下注射免疫WT小鼠对照组(WT-OVA);鼠沙门氏菌来源的FimH佐剂放大的WT小鼠佐剂组(WT-OVA+FimH-ST);cKO小鼠对照组(cKO-OVA);cKO小鼠佐剂组(cKO-OVA+FimH-ST)。腹腔注射2%戊巴比妥钠(100 mg/kg)麻醉小鼠后，在所有小鼠双侧颊黏膜下注射溶解于无菌PBS的OVA(5 mg/kg)。按照分组计划，在小鼠双侧颊黏膜下注射FimH-ST(500 μg/kg)或等量PBS,并记为第0周。在2周和4周重复上述治疗干预。在第3周用0.2%硝酸毛果芸香碱(7.5 mg/kg)腹腔注射处理小鼠，采集唾液；经过戊巴比妥钠麻醉小鼠后通过脸颊取血收集血液。第6周麻醉下颈椎脱臼处死小鼠，取小鼠颊黏膜和双侧下颌下和颈部引流淋巴结(draining lymph node, dLN)。

1.3.2 mRNA转录组高通量测序

微量提取试剂盒提取分选的稳态下DCs, 选择吸光度260/280 nm为1.8～2,RNA完整性(RIN)>8的样本进行文库构建。华大基因公司将RNA逆转录，使用SMART技术扩增构建文库。使用Agilent 2100(美国)对所构建的文库进行质量检测。质量检测合格的文库使用DNB-seq平台进行测序，并生成了100 bp的双端序列。

1.3.3 差异基因的鉴定和富集分析

使用FastQC对测序数据进行质量控制，Kallisto/sleuth对基因表达进行量化。使用R包“Sleuth”识别差异表达基因。Wald test(WT)检测每个基因的q值(显著性)和beta(β)值(cKO组与对WT组比值的log2对数)。q值<0.1和|beta|>1的基因(与WT组相比，cKO组上调或下调2倍)确定为差异表达基因(different expression genes, DEGs)。利用metascape(https: //metascape.org/gp/index.html)在线分析工具对DEGs的基因本体论(gene ontology, GO)生物过程(biological processes, BPs)、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路进行分析。每次富集分析都使用基因组中的所有基因作为富集背景。根据累积超几何分布计算P值，收集P值<0.01的项目。另外，使用GSEA软件分析两个KEGG通路——Toll样受体信号通路和mTOR信号通路的富集情况。

1.3.4 免疫酶联吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)测定血清和唾液中抗体表达水平

血液常温下静置30 min, 血液凝固后4 ℃冰箱过夜，2000 r/min离心10 min, 收集血清，于-80 ℃冰箱冻存。取待测血清加入PBS稀释(1∶500),后稀释为1∶500～1∶3200、唾液不稀释。10 μg/mL(W/V)OVA抗原包被96孔聚苯乙烯微量酶标板，4 ℃冰箱过夜。封闭孔板后用3%BSA/PBST分别稀释生物素耦联小鼠IgG1/IgG2b/IgA抗体，链酶亲和素-辣根过氧化物酶孵育后加入TMB溶液，室温避光孵育1 min。以2 mol/L硫酸终止反应，即刻测量波长为450 nm处的样本吸光充(A)值，分析读数结果。

1.3.5 流式细胞术

淋巴结用1 mL注射器尾部碾碎，加入1 mg/mL Ⅳ型胶原酶，37 ℃温箱内消化15 min, 用70 μL细胞晒网过滤，2500 r/min离心5 min后收集单细胞。颈椎脱臼处死小鼠，从下颌中切牙间剪开下颌骨，暴露出口腔，用眼科剪及显微镊分离口腔黏膜，将其上皮朝上平铺于1 mL Dispase Ⅱ消化液中37 ℃消化1.5 h; 撕下口腔黏膜上皮，剪碎，加入1 mL含有1 mg/mL Ⅳ型与1 mg/mL Ⅱ型胶原酶的混合溶液，37 ℃消化40 min。终止消化后过70 μm细胞筛，2500 r/min离心5 min后收集单细胞。单细胞转入96孔圆底细胞培养板，依次用Fc受体阻断剂孵育、流式抗体染色、FVS700 标记死细胞。LSRFortessa多维高清流式细胞分析仪检测。制备WT和cKO小鼠稳态下口腔黏膜单细胞经分选型流式细胞仪上分选DCs(CD45+CD11C+IA/IE+CD326+)。每只小鼠收集3000个DCs作为一个测序样本。

1.3.6 统计学分析

GraphPadPrism9.0软件用于实验数据分析，数据以表示，两组间比较采用t检验，多组之间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 DCs缺陷LKB1转录组学分析

分选WT和cKO小鼠的口腔黏膜DCs,转录组测序数据在q<0.1和|beta|>1的标准下鉴定出212个差异基因，其中cKO组相对WT组上调差异基因114个，下调差异基因98个。cKO组表达量上调的差异基因在GO分析中主要富集于免疫反应和免疫细胞活化等生物学过程。前20条目生物学过程中有8个是与免疫相关的，其中包括先天免疫反应、B细胞介导的免疫反应、白细胞活化和分化、单核细胞的迁移等(图1a)。上调基因富集到的KEGG通路包括金黄色葡萄球菌感染、利什曼病、自然杀伤细胞介导的细胞毒作用和溶酶体(图1b)。cKO组表达上调的基因在GSEA分析中富集到Toll样受体信号通路和mTOR 信号通路(图1c)。由于DCs缺陷LKB1后Toll样受体信号通路活化，并且促进B细胞反应，因此，提示其可能在疫苗黏膜免疫反应中有关键作用。我们后续采用经颊黏膜下接种FimH模式抗原，研究DCs缺陷LKB1是否影响黏膜佐剂和疫苗的免疫效应。

图1 野生型和DCs缺陷LKB1(cKO)细胞转录组差异性分析   

表1 接种疫苗后引流淋巴结B细胞群体的数目和比例

2.2 DCs缺陷LKB1对佐剂和疫苗免疫效果的影响

在第0周和第2周双侧颊黏膜下注射免疫小鼠后，于第3周采集小鼠眼眶血和唾液。通过ELISA法测定血清中OVA特异性抗体IgG1和IgG2b变化，发现WT小鼠经FimH-ST免疫后相比于仅使用OVA模式抗原免疫的小鼠血清中IgG1和IgG2水平升高，WT-OVA+FimH-ST组唾液中IgA吸光度为0.4相对显著升高(P<0.0001)。表明利用FimH-ST佐剂可以激活小鼠免疫反应形成抗体保护，FimH-ST佐剂应用于颊黏膜下免疫保护小鼠模型成功建立。此外值得注意的是，cKO-OVA组血清中OVA特异性IgG1水平与IgG2b的含量相比WT-OVA组曲线高(图2);并且cKO-OVA组的唾液中IgA水平相比WT-OVA组均值从0.29上升至0.428(P<0.0001),而cKO-OVA+FimH-ST组与cKO-OVA组的唾液IgA抗体滴度无明显差异，提示DCs缺陷LKB1之后佐剂效应消失。

图2 DCs缺陷LKB1对佐剂和疫苗免疫效果的影响  

2.3 DCs缺失LKB1对黏膜局部B细胞群体的影响

由于cKO小鼠抗体分泌能力增强，因此我们检测了黏膜局部包括口腔黏膜中浆细胞(CD19-B220-IgDintCD138hi),dLN中B细胞(CD45+CD19+B220+)和浆细胞群体变化。流式结果显示，相比WT-OVA组，WT-OVA+FimH-ST组内dLN中B细胞的比例显著上升(P<0.05),浆细胞的数目和比例都上升(P<0.05);同时，cKO-OVA组引流淋巴结中B细胞绝对数目相较WT-OVA组小鼠显著增加(P<0.05),浆细胞数目增多(P<0.05)。而cKO-OVA组的口腔黏膜浆细胞相对WT-OVA组数目升高，在B细胞中的占比未见明显差异(表1),这表明，cKO小鼠口腔黏膜浆细胞成熟程度更高，分泌能力更强。cKO-OVA+FimH-ST组浆细胞数目和比例相比cKO-OVA组变化不明显(表2),说明DCs缺陷LKB1之后丧失了佐剂的免疫放大效应，与前文提到抗体滴度一致。

表2 接种疫苗后口腔黏膜浆细胞的数目和比例变化

2.4 疫苗佐剂反应中LKB1通过DCs影响黏膜局部CD4+免疫调节细胞群体

辅助性CD4+T群体辅助B细胞的发育，为了研究DCs缺陷LKB1是否通过影响CD4+淋巴细胞群体类型和比例间接影响了抗体分泌能力，在第3次免疫2周后使用流式细胞仪检测小鼠滤泡辅助性T细胞(follicular helper T, Tfh)(CD45+CD3+CD4+CXCR5+PD-1+)、调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)(CD45+CD3+CD4+Foxp3+)群体。WT小鼠接受OVA和FimH-ST免疫后Tfh和Treg并没有显著性差异，这说明Tfh、Treg没有参与FimH-ST佐剂效应。cKO小鼠在OVA模式抗原作用下相对WT小鼠Treg增多(P<0.05),这一结果提示DCs的LKB1缺陷可能通过Treg细胞辅助B细胞发育，促进免疫防御。但是Treg的上升、佐剂组的低反应也表明这一调控过程可能也存在防止免疫过度，提示这一过程的复杂性。有趣的是cKO小鼠被FimH-ST增强免疫后引流淋巴结的Tfh细胞的比例上升(P<0.05,表3),提示在免疫反应的进一步刺激下，cKO小鼠调节黏膜免疫的潜力进一步被释放。以上结果说明LKB1可能在此过程的不同阶段发挥不同的主导作用。

表3 接种疫苗后口腔黏膜CD4+细胞亚型数目和比例

表4 疫苗免疫过程中对CD4+记忆性T细胞的影响

2.5 LKB1通过DCs在佐剂效应中对记忆细胞调节

CD4+记忆性 T细胞在疫苗中有十分重要的角色，DCs可以通过调控记忆T细胞参与疫苗免疫。我们于第3次免疫2周后使用流式细胞术检测小鼠颌下、颈部引流淋巴结效应记忆型T细胞(effective memory T cell, TEM)、中央型记忆T细胞(central memory T cell, TCM)群体变化。cKO小鼠在OVA模式抗原作用下CD4+TEM(CD4+CD62l-CD44hi)小鼠整体数目和比例相对WT小鼠上升(P<0.05),CD4+ TCM(CD4+CD62l+CD44hi)数目和比例上升(P<0.05,表4)。

3、讨论

黏膜系统经常暴露于各种类型的环境刺激物、病原体和过敏原，因此它“定制化”了相应的各种免疫耐受措施来保护人体免受各种环境病原体的侵害。由于共同黏膜淋巴组织的存在，经黏膜(鼻内和口腔)途径应用疫苗在诱导局部黏膜免疫和全身免疫方面具有独特优势[14]。口腔黏膜疫苗可以显著提升唾液腺和肠道抗体水平，对于龋齿等口腔疾病防治、肠道稳态调控有重要意义。在疫苗免疫中，大多数蛋白抗原在没有强效黏膜疫苗佐剂的帮助下只能产生低免疫反应[15],因此研究合适的佐剂并且探究其作用机制尤为重要。纯化的FimH-ST可以作为TLR4受体的配体上调共刺激分子和主要组织相容性复合体Ⅱ类分子(major histocompatibility complex class Ⅱ, MHC Ⅱ)的表达，体外诱导DC2.4细胞表型成熟，并且诱导细胞因子的产生和分泌[6,7]。FimH这类病原微生物来源的佐剂分子用于鼻黏膜免疫可以有效激活免疫反应，显著增加淋巴细胞增殖、干扰素γ应答和总抗体量[16]。FimH-ST注射免疫后可以维持6个月以上高效保护作用[17]。前期研究中，以单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A, MPL)和脂多糖作为阳性对照，发现FimH-ST可以在体外强有效地刺激DC2.4分泌炎症因子和活化DC2.4细胞[7],通过对比本文的实验结果(图2)中WT-OVA组与WT-OVA+FimH-ST组OVA特异性IgG1、IgG2b、IgA抗体水平，可以证实FimH-ST通过口腔黏膜下注射可以增强疫苗反应。FimH此类病原微生物来源的佐剂的毒性和不良反应在实际研究中不可忽略，本课题组其他研究中对FimH-ST滴鼻免疫进行了安全性评价，在为期20周的实验周期内动物体重与对照组相比无明显变化，重要脏器的组织病理性检测未见明显病变，证实其没有毒性。本次实验进行黏膜下注射FimH-ST,尽管未进行安全性相关检测，但在6周的实验周期中实验组和对照组小鼠体重无显著差异，未见小鼠出现毒性反应。本课题组后续将进一步进行相关实验以评估FimH-ST佐剂的安全性和毒性反应，以及注射 FimH-ST可能出现不良免疫反应的临界剂量和症状。

LKB1作为能量传感器AMP依赖的蛋白激酶[adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase, AMPK]信号通路上的关键蛋白，可在细胞内ATP降低时激活AMPK,诱导分解氧化代谢[18,19]。因此，LKB1以AMPK依赖性和不依赖性的方式调节DCs分化、代谢、存活和功能。DCs的能量代谢对于其调控T、B细胞活化有重要的意义[20],在本研究中DCs特异性缺陷LKB1后，高通量测序结果显示上调基因在免疫反应和B细胞反应中被富集。转录组数据提示，LKB1可能调控DCs上针对免疫反应尤其是B细胞功能，因此本研究设计了针对转基因小鼠口腔黏膜下注射疫苗的实验，探究DCs上LKB1是否调控佐剂反应。研究结果表明，DCs缺陷LKB1时，可以显著提高cKO-OVA组血清和唾液中特异性抗体水平，与此一致的是dLN中cKO-OVA相对WT-OVA组B细胞和浆细胞群体的上升。由此提示，LKB1缺陷可以打破黏膜的免疫耐受，增强B细胞的活化和浆细胞产生，继而提升抗体水平，增强疫苗的黏膜免疫效应。值得注意的是，佐剂FimH-ST辅助OVA模式抗原处理下与cKO-OVA组小鼠之间未观察到明显差异，dLN中B细胞数量在cKO-OVA+FimH-ST组相对cKO-OVA未见明显变化。因此认为，FimH-ST免疫佐剂效应与LKB1相关，DCs缺陷LKB1时，FimH-ST免疫佐剂效应则受到抑制。已有研究表明，脂多糖同为是TLR4激动剂，LPS会降低DCs上LKB1表达。这表明FimH-ST的佐剂效应可能与FimH-ST识别DCs表面TLR4降低DCs上LKB1表达相关，从而实现增强疫苗免疫效果，LKB1缺陷则不能发挥相应作用[10]。

DCs将抗原呈递给黏膜屏障中的MHC-Ⅱ限制性T细胞，以调控Th细胞群体，进而影响B细胞的发育和成熟[21]。例如Tfh向B细胞提供CD40L和IL-21,通过生发中心反应促进B细胞向记忆B细胞和产抗体的浆细胞的存活、增殖、Ig类型转换、成熟和分化，骨髓中的Treg支持浆细胞的形成[22]。此外，DCs还可以通过淋巴细胞迁移与T细胞、B细胞相互作用调控疫苗免疫反应，从而促进浆细胞分泌IgG1、IgG2b和IgA。本研究证实LKB1在DCs中表达调控口腔黏膜局部疫苗反应中B细胞发育、浆细胞形成，而且DC限制表达LKB1通过Tfh细胞和Treg细胞促进B细胞成熟。

综上所述，LKB1通过口腔黏膜DCs调控T细胞群体，尤其是通过Tfh和Treg细胞影响B细胞的发育成熟和抗体分泌。DCs表达LKB1维持免疫稳态， LKB1的缺失会导致Treg、记忆细胞群体和B细胞扩增，机体免疫耐受，致使佐剂无法放大免疫效应。这类现象为口腔黏膜疫苗的研发与应用提供了一个新的视角。LKB1对黏膜疫苗的免疫反应，以及对佐剂效应的调节相关信号通路仍需进一步深入的研究。

参考文献:

[2]田源,陈靖,曾凤娇,等.SD大鼠经鼻黏膜免疫牙周炎基因疫苗pVAX1-HA2-FimA-(IL-15)后Tfh细胞的变化[J].口腔医学研究,2020,36(4):350-354.

[8]刘忠芳,陈林,殷晓佳,等.FimH重组蛋白的原核表达及纯化[J].口腔医学研究,2013,29(10):893-896.

基金资助:国家自然科学基金(编号:81670981);

文章来源:刘馨远,林玉红,陈君兰,等.树突状细胞肝激酶B1信号对FimH黏膜佐剂效应的影响[J].口腔医学研究,2024,40(05):393-400.