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瑞马唑仑通过调节Toll样受体4对脂多糖诱导的小胶质细胞M1型极化影响

2025-01-20 32 上传者：管理员

摘要：目的评价瑞马唑仑在脂多糖诱导的M1型小胶质细胞极化中的作用及其与Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)的关系。方法将生长良好的BV2小胶质细胞采用随机数字表法分为5组(n=20):对照组、脂多糖组、瑞马唑仑+脂多糖组(瑞马唑仑组)、瑞马唑仑+脂多糖+Neoseptin-3组(激动剂组)、瑞马唑仑+脂多糖+二甲基亚砜组(激动剂对照组)。对照组置于正常条件下培养，脂多糖组加入浓度为1μg/ml的脂多糖孵育24 h,瑞马唑仑组经100μg/ml瑞马唑仑预处理20 min,激动剂组和激动剂对照组分别给予TLR4激动剂Neoseptin-3 50μmol(用二甲基亚砜溶解)和等容量二甲基亚砜孵育1 h。采用酶联免疫吸附测定法检测细胞上清液肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)、白细胞介素(interleukin, IL)-1β水平，采用定量逆转录聚合酶链反应法检测M1型小胶质细胞标志物诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)和TLR4 mRNA表达水平。结果与对照组比较，其余4组细胞上清液TNF-α、IL-1β、iNOS和TLR4蛋白及其mRNA表达明显升高(P<0.05)。与脂多糖组比较，瑞马唑仑组细胞上清液TNF-α、IL-1β、iNOS和TLR4蛋白及其mRNA表达明显降低(P<0.05)。与瑞马唑仑组比较，激动剂组细胞上清液TNF-α、IL-1β水平、iNOS和TLR4蛋白及其mRNA表达明显升高(P<0.05)。激动剂对照组上清液TNF-α、IL-1β水平、iNOS和TLR4蛋白及其mRNA与瑞马唑仑组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。脂多糖组iNOS表达明显高于对照组[(14.757±0.986)%vs(1.561±0.08)%,P<0.05]。瑞马唑仑组iNOS表达明显低于脂多糖组[(3.767±0.364)%vs(14.757±0.986)%,P<0.05]。激动剂组iNOS表达高于瑞马唑仑组[(6.827±0.642)%vs(3.767±0.364)%,P<0.05]。激动剂对照组与瑞马唑仑组iNOS表达比较，无统计学差异(P>0.05)。结论瑞马唑仑抑制脂多糖诱导的M1型小胶质细胞极化的机制与下调TLR4的表达有关。

关键词：
Toll样受体4
免疫效应细胞
小神经胶质细胞
脂多糖类
苯二氮卓类药物
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小胶质细胞是中枢神经系统主要的免疫效应细胞，其促炎或抑炎作用取决于它的激活状态[1]。激活的小胶质细胞根据功能和标志物分为M1、M2表型[2]。M1型小胶质细胞释放大量促炎因子，加重组织损伤[3]。体外研究证实，脂多糖可以诱导小胶质细胞向M1表型极化[4]。瑞马唑仑是一种新型超短效苯二氮类药物，其在临床中表现出呼吸抑制轻、起效快、恢复快、安全性高的特点[5]。研究表明，瑞马唑仑可以抑制肝巨噬细胞向M1表型极化，从而减轻炎性反应[6]。Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)是一种天然免疫模式识别受体，它被脂多糖激活后调控炎性因子释放，参与疾病的发生发展[7]。有研究表明，瑞马唑仑可以下调巨噬细胞表面TLR4表达，从而减少促炎细胞因子的释放[8]。本研究拟评价瑞马唑仑对脂多糖诱导的M1型小胶质细胞极化的影响及其与TLR4的关系，为治疗神经系统疾病提供实验依据。

1、材料与方法

1.1细胞

小胶质细胞BV2购自山东科赛生物科技有限公司，使用含10%胎牛血清(Gibco公司，美国)、1%青霉素链霉素抗生素(HyClone公司，美国)的达尔伯克改良伊格尔培养液/F12(Gibco公司，美国)培养液培养，置于37℃、5%CO2培养箱(Gibco公司，美国)中静置培养。每2 d换1次液，待细胞达到对数生长期(密度80%～90%)时用于实验。

1.2细胞分组

选择处于对数生长阶段的细胞，并在6孔板中以1×105个/孔的密度进行接种，之后将其放置在37℃、5%CO2的培养箱里进行培养。将小胶质细胞采用随机数字表法分为5组(n=20):对照组、脂多糖组、瑞马唑仑+脂多糖组(瑞马唑仑组)、瑞马唑仑+脂多糖+Neoseptin-3组(激动剂组)、瑞马唑仑+脂多糖+二甲基亚砜组(激动剂对照组)。根据前期预实验的结果和参考文献，脂多糖组加入1μg/ml的脂多糖(上海碧云天生物技术公司)培养液置于正常条件下孵育24 h[9]。根据前期预实验的结果和参考文献，瑞马唑仑组经100μg/ml的瑞马唑仑预处理20 min后加入1μg/ml的脂多糖培养液置于正常条件下孵育24 h[8]。根据前期预实验的结果和参考文献，给予TLR4激动剂Neoseptin-3 50μmol(用二甲基亚砜溶解)孵育1 h后，经100μg/ml瑞马唑仑预处理20 min,再加入浓度为1μg/ml脂多糖培养液孵育24 h,激动剂对照组给予等容量二甲基亚砜孵育1 h后经100μg/ml瑞马唑仑预处理20 min,再加入浓度为1μg/ml脂多糖培养液孵育24 h[10]。

1.3方法

1.3.1酶联免疫吸附测定法检测

取对数生长期的BV2细胞，以1×106/ml的密度接种于六孔板中，每孔100μl。置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中进行培养，待细胞融合度达到80%时，根据实验进行分组并进行造模、处理细胞，收集细胞上清液，采用酶联免疫吸附测定法检测炎性因子：肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)和白细胞介素(interleukin, IL)-1β水平，使用酶标仪测定450 nm处吸光度，绘制标准曲线，计算TNF-α和IL-1β水平。

1.3.2定量逆转录聚合酶链反应法检测

取对数生长期的BV2细胞，以1×106/ml的密度接种于六孔板中，根据RNA提取试剂盒的使用指南，提取各组BV2细胞的RNA,并使用紫外分光光度计来测定RNA的浓度。接着，使用Takara逆转录试剂盒将各组的总RNA反转录成cDNA,产物进行聚合酶链反应。使用信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)的TB GreenPremix Ex TaqⅡ试剂盒(Takara公司，日本)制备聚合酶链反应体系，并于ABI7300荧光实时定量聚合酶链反应仪(CA公司，美国)检测诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)和TLR4 mRNA表达。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogr-nase, GAPDH)上游：5′-ACCCGCAGACCTCTC-ATTCT-3′;下游：5′-TGACAACGTTGGGTGAA-AAA-3′;iNOS上游：5′-GCTTGTCTCTGGGTCCTCTC-3′,下游：5′-CTCACTGGGACAGCACAG-AA-3′;TLR4上游：5′-TGGTGGCTGTGGAGACAAAAATGAC-3′;下游：5′-TGGTGGCTGTGGAGACAAAAATGAC-3′。根据公式计算出各组细胞中目的基因表达/对照组细胞中目的基因表达=2-ΔΔCt。

1.3.3 Western blot检测

细胞洗涤2遍。洗涤后加入配置好的RIPA裂解液，细胞经裂解后，收集12 000 g的裂解液，4℃离心5 min,从中提取出全蛋白提取物，测定其总蛋白浓度。蛋白质样品中加入缓冲液，混匀，100℃煮沸5 min使蛋白变性，复温后离心收集上清液，加入到十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶加样孔中电泳。转膜结束后，洗膜5 min×3次。用5%(质量浓度)脱脂牛奶在室温下孵育2 h。加入一抗，4℃过夜。次日洗膜，加入二抗，室温下孵育2 h,洗膜。曝光、显影和定影处理后，使用Image J图像分析软件来测量各组蛋白的表达情况，并通过比较目的蛋白条带灰度值与GAPDH条带灰度值的比值来反映目的蛋白的表达水平。

1.3.4免疫荧光染色法检测iNOS的表达

在6孔板上将细胞接种，然后将其放置在37℃、5%CO2的恒温培养箱中进行培养，根据实验进行分组并进行造模、处理细胞，处理后每孔加入1 ml的4%多聚甲醛(上海碧云天生物科技有限公司)固定30 min, PBS反复漂洗细胞，采用免疫荧光封闭液(上海碧云天生物科技有限公司)室温封闭1 h,弃封闭液，孵育iNOS(1〯500,Abcam公司，英国),4℃过夜。次日避光孵育相应二抗(1〯500,碧云天生物科技有限公司)1 h, PBS漂洗后孵育DAPI(上海碧云天生物科技有限公司),最后使用抗荧光淬灭剂封固(上海碧云天生物科技有限公司),运用共聚焦显微镜采集图像，图像采用Image J软件分析。

1.4统计学方法

使用SPSS.22.0软件进行数据统计学分析，其中正态分布的计量数据以表示，采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1各组BV2细胞上清液TNF-α和IL-1β水平比较

与对照组比较，其余4组细胞上清液TNF-α、IL-1β水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05);瑞马唑仑组、激动剂组、激动剂对照组细胞上清液TNF-α、IL-1β水平明显低于脂多糖组(P<0.05);激动剂组细胞上清液TNF-α、IL-1β水平明显高于瑞马唑仑组(P<0.05)。激动剂对照组细胞上清液TNF-α和IL-1β水平与瑞马唑仑组比较，差异无统计学意义(P>0.05,表1)。

表1各组细胞上清液TNF-α和IL-1β 水平的比较(pg/ml,

2.2各组细胞iNOS蛋白及mRNA表达比较

与对照组比较，其余4组iNOS蛋白及其mRNA表达明显升高(P<0.05)。瑞马唑仑组、激动剂组、激动剂对照组iNOS蛋白及其mRNA表达明显低于脂多糖组(P<0.05)。激动剂组iNOS蛋白及其mRNA表达明显高于瑞马唑仑组(P<0.05)。激动剂对照组与瑞马唑仑组iNOS蛋白及其mRNA比较，差异无统计学意义(P>0.05,表2,图1)。

表2各组细胞iNOS蛋白及mRNA表达比较

图1各组细胞iNOS和TLR4蛋白表达

2.3各组细胞TLR4蛋白及mRNA表达比较

与对照组比较，其余4组TLR4蛋白及其mRNA表达明显升高(P<0.05);瑞马唑仑组、激动剂组、激动剂对照组TLR4蛋白及其mRNA表达明显低于脂多糖组，激动剂组TLR4蛋白及其mRNA表达明显高于瑞马唑仑组(P<0.05),激动剂对照组TLR4蛋白及其mRNA与瑞马唑仑组相比较，差异无统计学意义(P>0.05,表3)。

表3各组细胞TLR4蛋白及mRNA表达比较

2.4各组iNOS免疫荧光表达的比较

脂多糖组iNOS表达明显高于对照组[(14.757±0.986)%vs(1.561±0.08)%,P<0.05]。瑞马唑仑组iNOS表达明显低于脂多糖组[(3.767±0.364)%vs(14.757±0.986)%,P<0.05]。激动剂组iNOS表达高于瑞马唑仑组，差异有统计学意义[(6.827±0.642)%vs(3.767±0.364)%,P<0.05]。激动剂对照组与瑞马唑仑组iNOS表达比较，差异无统计学意义[(4.197±0.390)%vs(3.767±0.364)%,P>0.05,图2]。

3、讨论

BV2小胶质细胞是原代小胶质细胞感染了携带癌基因v-raf/v-myc的反转录病毒J2后而得到的永生细胞系，可以作为体外模型来研究神经炎症[11]。当有外伤、感染、压力等刺激时它由静止状态向活化状态转变，并极化为两种表型，M1促炎表型和M2抗炎表型。M1型释放TNF-α、IL-1β等促炎因子，促炎细胞因子通过炎性小体和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族蛋白介导的坏死、凋亡和焦亡等途径导致神经元死亡，加重脑损伤[12-13]。体外条件下，脂多糖刺激小胶质细胞向M1表型极化，促进炎性反应[4]。本研究根据预实验和参照文献，应用1μg/ml的脂多糖培养液孵育小胶质细胞24 h[9]。研究结果显示，与对照组比较，脂多糖组细胞上清液TNF-α、IL-1β水平增加，M1型小胶质细胞标志物iNOS及其mRNA表达上调，提示脂多糖诱导小胶质细胞向M1型极化成功。

调节小胶质细胞的极化状态可以干预神经炎症的发生和进展，对于神经系统疾病的发展和预后有重要研究意义[14]。瑞马唑仑主要作用于γ氨基丁酸受体，抑制兴奋性神经元，发挥镇静作用。有研究表明，瑞马唑仑可以促进肝巨噬细胞从M1表型向M2表型转化，减少促炎因子释放，减轻肝损伤[6]。本研究根据前期预实验的结果和参考文献，瑞马唑仑组经100μg/ml的瑞马唑仑预处理20 min后加入1μg/ml的脂多糖培养液置于正常条件下孵育24 h[8]。结果表明，与脂多糖组比较，瑞马唑仑组细胞上清液TNF-α、IL-1β水平明显降低，iNOS及其mRNA表达明显下调，表明瑞马唑仑抑制脂多糖诱导的小胶质细胞向M1型极化，减轻炎性反应。

图2各组细胞iNOS表达免疫荧光检测×200

TLR4是一种I型跨膜蛋白，表达于巨噬细胞等多种组织细胞表面，可以识别脂多糖，参与信号转导，在调节炎症、免疫反应发生等过程调控中发挥重要作用[15]。有研究表明，瑞马唑仑能够减少巨噬细胞表面TLR4蛋白表达，从而减轻炎症[8]。本研究参照参考文献，激动剂组给予TLR4激动剂Neoseptin-3 50μmol[10]。结果显示，与瑞马唑仑组比较，激动剂组TLR4蛋白及其mRNA表达明显上调，说明Neoseptin-3成功激动TLR4;与对照组比较，脂多糖组TLR4蛋白及其mRNA表达明显上调；与脂多糖组比较，瑞马唑仑组TLR4蛋白及其mRNA表达明显下调，提示瑞马唑仑抑制脂多糖诱导小胶质细胞M1型极化可能与TLR4有关，与瑞马唑仑组比较，激动剂组细胞上清液TNF-α、IL-1β水平明显增加；M1型标志物iNOS及其mRNA表达明显上调，这提示瑞马唑仑对M1型小胶质细胞极化的抑制作用减弱，表明瑞马唑仑通过影响TLR4表达，进而调节小胶质细胞极化水平。

二甲基亚砜是TLR4激动剂Neoseptin-3的溶剂，因此设计溶剂对照组。与瑞马唑仑组相比，激动剂对照组细胞上清液TNF-α和IL-1β水平、M1表型标志物iNOS、TLR4及其mRNA的表达均无统计学差异，因此可以排除溶剂对实验结果的影响。

本研究具有局限性，仅在细胞水平上探讨了瑞马唑仑对脂多糖诱导的小胶质细胞M1型极化的影响和分子机制，尚未进行动物实验，未探讨小胶质细胞M2型极化及分子机制，未来需建立动物模型进一步验证，并明确瑞马唑仑对小胶质细胞M2型极化的影响和分子机制。

综上所述，瑞马唑仑抑制脂多糖诱导的小胶质细胞极化与下调TLR4的表达有关。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献:

[11]张香香,于春锐,姜丰,等.miR-124-3p在电刺激预处理减轻小胶质细胞氧糖剥夺-复糖复氧损伤中的作用:与小胶质细胞极化的关系[J].中华麻醉学杂志,2023,43(7):863-867.

基金资助:山东省自然科学基金(ZR2021MH365);青岛市市南区科技计划项目(2023-2-012-YY);山东省医学会临床科研专项资金(YXH2021ZX011);

文章来源:姜丰,李婧,刘文洁,等.瑞马唑仑通过调节Toll样受体4对脂多糖诱导的小胶质细胞M1型极化的影响[J].中华老年心脑血管病杂志,2025,27(01):100-104.