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诱导多能干细胞来源自然杀伤细胞的生物学特性

2024-08-08 58 上传者：管理员

摘要：目的：利用诱导多能干细胞（iPSCs）建立体外扩增分化体系并进一步诱导分化为自然杀伤（NK）细胞。探讨iPSCs来源分化体系诱导分化来的NK细胞的生物学特性。方法：获取iPSCs,通过流式细胞术检测细胞分化功能的水平。结果：iPSCs经扩增和筛选，最后获得了可稳定未分化增殖的iPSCs,利用iPSCs成功分化NK细胞。结论：利用iPSC源分化体系成功在体外诱导出NK细胞，可产生大于90%CD45+CD56+细胞，有统计学差异（P<0.05）。NK细胞分化基本完全完成。其免疫表型的比例差异提示iPSCs-NK细胞具有不同的生物学特性。

关键词：
NK
先天性淋巴细胞
生物学特性
自然杀伤细胞
诱导多能干细胞
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自然杀伤细胞(natural killer cells, NK)属于先天性淋巴细胞，是先天免疫系统的重要组成部分[1]。它们主要通过执行细胞毒性反应和分泌促进炎症的因子来发挥作用。由于NK细胞上没有抗原识别受体，不会引起移植物抗宿主病，可以避免细胞因子风暴。NK不仅可以检测和识别恶性癌细胞，还可以诱导癌细胞死亡，有助于触发更广泛的适应性免疫反应，充分参与和对抗肿瘤细胞用于治疗众多的难治性恶性肿瘤患者。因此，NK作为一种现货型细胞治疗产品，可以作为储备供广大患者使用[2]。但NK种子的来源有限，一般来自于外周血以及脐带血，杀伤活性以及扩增都存在非常大的问题。因此迫切需要探寻从体外扩展到临床规模的NK分化扩增体系，并且要维持扩增得到的NK从体外到体内的存活率和生物活性。除了NK分化扩增制造过程中的困难外，为特定患者选择合适的NK供体以改善临床结果以及维持体内存活和活性的能力是当前NK生产策略面临的另一个阻碍其疗效的重大挑战[3]。这些挑战可以通过新的iPSC-NK工具和基因工程方法来解决。由于NK在人体内含量很少，难以从患者体内分离出足够数量的NK,这限制了其在免疫治疗中的应用。而诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)可以无限期地自我更新，所以一旦开发出一种单一的细胞系，可以用诱导多能干细胞衍生的NK治疗的患者数量假设是无限的，是很好的研究资源[4]。然而，这是一个漫长的生产过程，如何高效简易的将人诱导多能干细胞在体外分化成自然杀伤细胞成为重要挑战。因此，寻找一种有效的方法来建立促进干细胞向NK的分化体系，增强其分化发育效率和功能性，具有重要的意义。包括胚胎干细胞(embryonal stem cell, ESC)和诱导多能干细胞(iPSC),构成了组织工程和再生医学领域中的关键细胞资源[5]。iPSCs的出现提供了研究早期人类血液发育的绝佳途径，以及可用于免疫疗法的具有临床重要性的细胞的无限来源。此外，从遗传性疾病患者中产生iPSC衍生的造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSC)和永久造血内皮(hematopoietic endothelial, HE)可以允许通过高通量药物筛选进行重要疾病建模和获得新的治疗方法[6]。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1

本实验中使用正常显示的核型iPSCs, 人慢性髓系白血病细胞K562细胞由陆军军医大学分析测试中心提供。

1.1.2 主要试剂

(ROCK)抑制剂(1254)获自 Tocris Bioscience(Bristol, UK),由中盛溯源生物科技有限公司提供。干细胞因子(SCF)(300-07)、rh骨形态发生蛋白4(120-05)、rh 血管内皮生长因子(100-20B)、rhIL-3(200-03)、rhIL-7(200-07)和rhFlt3-L(300-19)从PeproTech(BioLegend)获得。STEMdiff APEL 2 (05270)分化培养基从 STEMCELL Technologies 获得。

1.2 实验方法

1.2.1 iPSCs三胚层分化能力检测：

将良好生长的iPSCs均匀分配至6孔板中，各谱系的接种密度分别为 2×106个细胞/孔，通过流式细胞术以检测细胞的干性。

1.2.2 iPSCs细胞系培养与扩增：

当iPSCs达到第4代时，收获分化稳定的细胞。通过显微镜观察细胞分化良好的单克隆集落，并将其转移至含有nCT+Y培养基和Matrigel处理的6孔板中培养。

1.2.3 iPSC-NK细胞获取体系分为两个阶段：

(1) iPSC 来源的造血祖细胞的分化

在分化之前，复苏iPSC 细胞系，并在人多能诱导干细胞(hiPSC)合格的基质凝胶包被的6孔板中在 nCT无饲养细胞维持培养基中培养4～5d, 达到80%汇合度时准备传代。传代前，制备造血分化培养基，由STEMdiff APEL 2、40ng/mL SCF、20ng/mL BMP4和20ng/mL VEGF组成，前3d补充10mM ROCK 抑制剂。iPSCs传代培养接种在100mL含有(ROCK)抑制剂的培养基中超低吸附、圆底96孔板(CLS3474Corning)内，密度为3000个细胞/孔。细胞在220g离心5min, 以促进胚状体(EB)结构的形成，并在37℃和5% CO2下不受干扰地孵育3d。在第4天、第8天，通过从每个孔中取出70μL培养基并加入100μL新鲜制备的不含(ROCK)抑制剂的造血分化培养基来进行培养基更换。在第12天，收集造血祖细胞用于流式细胞仪分析。

(2) iPSC 来源的造血祖细胞产生成熟的NK细胞

造血祖细胞以14EBs/孔的浓度接种在标准细胞培养处理的6孔板中的4mL NK 细胞分化培养基中，所述培养基由 STEMdiff APEL 2、20ng/mL SCF、20ng/mL IL-7、10ng/mL IL-15和10ng/mL Flt3L组成，其中补充了5ng/mL IL-3。仅在第1周用新鲜制备的含有IL-3的NK细胞分化培养基替换一半的培养基，每周两次，持续4周，在随后的3周中不含 IL-3。在4周的 NK 细胞分化培养后，收集细胞并通过流式细胞仪进行表型分析，或者在细胞毒性和功能性分析之前，在补充有5% hAB血清、1%青霉素/链霉素、0.2mM L-谷氨酰胺、10ng/mL rhIL-15、500IU/mL rhIL-2 的RPM1培养基中扩增3～4周。

1.3 统计学方法

采用Graphpad Prism 8.0进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 iPSCs 多能性特征

获得iPSCs 进行多能性鉴定。流式分析结果显示，多能性标志物TRA-181表达达到 95.2﹪,有统计学意义(P<0.05),证明通过诱导性iPSCs 具有多能性特征，见图1。

图1 iPSC的分化多能性

2.2 iPSC分化成NK过程中不同时间点的分化

iPSC-NK的分化总共28d。总共分为两个阶段。第一个阶段经历造血发育获得造血干细胞，体外离心法通过拟胚体形成技术模拟造血发育；第二阶段经历造血发育后，造血干细胞定向NK细胞分化。EB在没有解离或细胞分选的情况下被转移到含有促进成熟NK细胞发育的细胞因子的NK细胞分化培养基中进行淋巴谱系的分化，见图2～3。

图2 hpsc衍生iPSC- NK细胞分化的方案

图3 iPSC的分化形态学特征(40×)

2.3 iPSCs-NK 具有典型的 NK 表型

2.3.1 评估中胚层标志物的表达

未成熟的内皮细胞和侧板中胚层上的分子标志物-酪氨酸激酶受体(kinase insertdomain receptor, KDR)。检测结果显示，应用本研究方法制备的细胞群KDR表达95.1%,有统计学意义(P<0.05),见图4。

图4 中胚层标志物

2.3.2 评估EHT生血内皮标志物的表达

检测造血祖细胞相关标志物CD34和CD43的表达，结果发现，CD34比例表达24.4%,CD43比例表达2.62% ,有统计学意义(P<0.05),见图5。

2.3.3 评估早期造血阶段标志物的表达

检测表达造血祖细胞相关标志物CD34和CD43的表达，结果发现，CD34比例表达45.1%,有统计学意义(P<0.05),见图6。

图5 EHT生血内皮标志物

图6 造血阶段标志物

2.3.4 评估iPSC-NK表面标志物的表达

检测NK细胞(CD45+CD56+)比例，当产生大于90% CD45+CD56+细胞，NK细胞分化基本完成，有统计学意义(P<0.05),见图7。

图7 iPSC-NK 细胞表面标志物

3、讨论

NK是一类重要的淋巴细胞亚群，对免疫系统的正常功能和免疫应答起着至关重要的作用[7]。NK具有独特的功能和特性，不仅参与了早期的免疫应答，还在肿瘤免疫监视、感染控制和免疫调节等方面发挥着重要的作用[8]。近几年肿瘤治疗中，细胞免疫疗法正在成为国内外关注的焦点[9]。NK不需要人类白细胞抗原(HLA)匹配，因此NK被允许作为异体基因治疗的重要手段[10]。尽管NK具有强大的抗肿瘤活性，但它们面临着疗效低的重大挑战。这些难题可以通过新的 iPSC-NK 工具和基因工程方法来解决。由于NK在人体内含量很少，难以从患者体内分离出足够数量的NK,这限制了其在免疫治疗中的应用[11]。因此，急需一种iPSCs在体外分化成NK的方法[12]。而iPSCs可以无限期地自我更新[13]。然而，这是一个漫长的生产过程，如何高效简易的将人iPSCs在体外分化成NK成为重要挑战[14]。因此，寻找一种有效的方法来促进干细胞向NK的分化，增强其分化发育效率和功能性，具有重要的意义[15,16]。本实验首先建立培养iPSC稳定的细胞株，利用流式细胞术检测干细胞处于未分化程度。然后确定iPSC的培养到第8天时，流式细胞术检测CD34、CD43阳性表达率。当CD34>30%时，进入NK分化阶段。分化阶段每个关键节点检测悬浮细胞表面标志物CD45+CD56+表达情况。当产生大于90% CD45+CD56+细胞，可以产生大量成熟的NK,NK分化完成。

综上所述，在iPSC-NK分化培养体系中，能在不同时间段获取NK。可以为NK的规模化提供更好的培养体系。但有时培养过程不够稳定，还需摸索培养条件，我们有望揭示干细胞分化为NK的关键调控途径，为干细胞治疗和免疫疗法的发展提供新的理论和实证基础，从而为改善免疫治疗的效果和应用前景作出贡献。

参考文献:

[15]杨庆伟,梁海鹏,陈小鹏,等.南蛇藤总萜对人食道癌Eca-109细胞增殖和侵袭转移的影响[J].黑龙江医药科学,2020,43(1):27-29.

[16]杨威,王丹丹,贾琳琳.IL-6与糖尿病并发抑郁症相关性研究[J].黑龙江医药科学,2020,43(1):3-4,2.

基金资助:黑龙江省卫生健康委科研课题,编号:20210202070029;

文章来源:杨碧云,刘涛,毕清华,等.诱导多能干细胞来源自然杀伤细胞的生物学特性[J].黑龙江医药科学,2024,47(04):9-12.