膀胱癌是最常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤，其发病率和死亡率均居泌尿系统肿瘤的首位。2012年全世界大约有43万膀胱癌新病例被确诊，16万例死亡[1]。2013年中国报告膀胱癌新发病例为7.44万例，发病率为5.46/10万，死亡病例为2.93万例,死亡率为2.16/10万[2]。目前多种方法联合治疗膀胱癌的治疗方案虽然取得了显著的成果，但是膀胱癌的预后效果仍然不理想，非肌肉浸润性膀胱癌患者的复发率高达50%～80%[3]。故深入研究膀胱癌发生和发展的分子机制，不断寻找出新的肿瘤分子生物标志物，对膀胱癌的早期诊断、治疗和预后提供新的方案，有非常重要的意义。DNA甲基化是表观遗传学重要的组成部分，能引起染色质结构、DNA稳定性等方面的改变[4]，从而调控基因的表达。相关基因在膀胱癌中的DNA甲基化异常，以及DNA甲基化与膀胱癌的早期诊断、治疗及预后的研究成为热点。

1、DNA甲基化的研究现状

DNA甲基化是指由DNA甲基化转移酶（DNMTs）介导的，能够使得CPG二核苷酸的5’端的胞嘧啶碳原子上加上1个甲基，使其变成5’端甲基胞嘧啶的修饰过程，是植物、动物等真核生物DNA甲基化的主要形式，也是目前发现哺乳动物DNA甲基化的唯一形式。在哺乳动物中已鉴定出DNMT家族的五个成员：DN-MT1,DNMT2,DNMT3a,DNMT3b和DNMT3L。DNMT1维持甲基化的功能状态，DNMT3a和DNMT3b是将甲基化标记添加到DNA中的转移酶，在DNA甲基化过程中有着实质性的催化作用[5]。由于DNMT2缺乏N端的调节结构域，DNMT3L缺乏C端的催化结构域，DNMT2和DNMT3L在DNA甲基化过程中起到的作用很小。CpG岛在正常组织中，通常都是非甲基化的，一旦CpG岛发生高甲基化，可能会导致抑癌基因的表达下降。DNMT的调节失控和CpG岛的高甲基化都是肿瘤中普遍存在的现象，亦是肿瘤发生和发展的重要机制，下面对DNMT和CpG岛进行简单的介绍。

1.1DNMT1

DNMT1是一种具有复杂结构域的酶，它包含一个N末端调节性区域和一个C末端催化结构域，N末端区域包含增殖细胞核抗原结合结构域PBD，复制灶靶向序列RFTS,CXXC结构域和两个相邻的BAH结构域（bromo-adjacenthomology1and2,BAH1和BAH2)[6]。PCNA有利于DNMT1募集，也可以修饰RFTS序列[7]。CXXC结构域是一个小的锌指结构域，由50-70个氨基酸组成，它可以选择性识别未修饰的CpGDNA[8],CXXC结构域的一级结构包括两个半胱氨酸簇（分别由6个和2个半胱氨酸残基组成），两个半胱氨酸簇之间包含着高度保守的KFGG基序，KFGG基序不参与特异性序列DNA间相互作用的过程，但可能为CxxC域的折叠起着十分重要的作用。CXXC域后是两个串联的BAH域，两个BAH域通过哑铃形的α-螺旋连接，BAH1域与CXXC域可通过长接头片段连接，BAH2结构域具有延伸的长突起环，其远端与催化结构域中的靶向识别域（TRD）相互作用[9]。最近研究[10]发现，热休克蛋白90抑制剂能够诱导DNMT1的降解，从而抑制膀胱癌的DNA甲基化。有学者在研究DNMT1与膀胱癌肿瘤增殖和凋亡程度的相关性发现，抑制DNMT1的表达可抑制膀胱肿瘤细胞的增殖和促进细胞凋亡[11]。DNMT1在结构上的复杂性是维持甲基化酶的活性，发挥甲基化功能的基础，它在膀胱癌的发生和发展的过程中是一个重要的作用因子。

1.2DNMT2

尽管DNMT2酶和其它DNA甲基转移酶具有很高的序列和结构相似性，最初也一直被认为是DNA甲基化转移酶，但它对DNA的催化活性非常弱，Goll等[12]发现Dnmt2酶实际上是tRNA转移酶，它能够特异性甲基化tRNA(Asp）反密码子环38C，除了tRNA(Asp）之外，tRNA(Glu）和tRNA(Gly）也可被Dnmt2甲基化[13]。DNMT2不是DNA甲基化转移酶，而是一种tRNA甲基转移酶，是现在大多数学者的观点。

1.3DNMT3

DNMT3包括三个亚型：DNMT3a,DN-MT3b,DNMT3L,DNMT3L是缺乏催化结构域的调节蛋白，不能作用于启动子甲基化。而有从头合成甲基化功能的是DNMT3a和DNMT3b，它们的N端部分存在两个子域，PWWP域和ADD域。PWWP域包含100-150个氨基酸残基，其特征是Pro-Trp-Trp-Pro的核心序列，该结构域有助于蛋白质-蛋白质的相互作用，特别是对参与细胞分裂，生长和分化的蛋白质。ADD域是一个富含半胱氨酸的区域，可结合锌离子并为蛋白质-蛋白质相互作用提供有利条件，该结构域介导了DNMT3酶与赖氨酸K4未甲基化的组蛋白H3尾部的相互作用[14]。Dnmt3a的PWWP结构域和胸腺嘧啶DNA糖基化酶（TDG）的相互作用可以抑制Dnmt3a的DNA甲基化活性，Dnmt3b的PWWP结构域包括5个β-折叠的β-桶形结构和一个五螺旋束，域表面上带正电荷的Lys和Arg残基是DNA结合的位点[15]。DNMT3a的ADD结构域在两个不同的界面上与催化域形成接触，形成一个自抑制位点阻碍DNA结合，从而抑制催化域的活性，另外一个变构位点则不会抑制[16]。DNMT3a一方面具有调控基因内部甲基化，另外还可重新激活沉默的保守染色质区域。DNMT3b主要催化微卫星的DNA甲基化，它的突变可影响其蛋白功能进而导致微卫星DNA低甲基化[17]。

1.4CpG岛

恶性肿瘤的形成往往是因为抑癌基因的失活或致癌基因的激活，基因启动子区的异常甲基化是抑癌基因及其它基因失活的最常见机制之一，它主要是通过CpG岛中的胞嘧啶甲基化修饰而使得抑癌基因的功能丧失[18,19]。在正常组织中通常CpG岛是非甲基化的，它一般位于管家基因，发育基因和组织特异性基因的启动子中，允许下游基因的表达，其转录通过组蛋白修饰进一步调节[20]。Shirin等[21]通过对胃腺癌的三个抑癌基因EphA5,HS3ST2和CDH11的CpG岛进行甲基化分析，发现CpG岛超甲基化导致这三个基因不同程度的低表达。Pence等[22]对CpG岛内的miRNAs表达情况进行分析，发现miR-21、miR-155、miR-23b、miR-126、miR-129-5p、miR-143a和miR-218-5p的CpG岛甲基化变化与膀胱癌相关。在膀胱癌及其它肿瘤中，CpG岛的高度甲基化会造成染色质的构象发生改变，抑癌基因的表达被抑制，从而导致细胞凋亡受限，DNA修复缺陷，血管生成以及细胞粘附功能缺失等，最终导致肿瘤的发生。

2、基因异常甲基化与膀胱癌

2.1基因高甲基化与膀胱癌

DNA异常高度甲基化通常会影响DNA的构象，进而阻遏基因转录，导致基因的沉默。RGS2是属于G蛋白信号调节蛋白家族中的一员，在大多数实体瘤中均被下调，被认为是抑癌基因[23]，具有PHD和环指结构域1的泛素样蛋白（UHRF1）是重要的DNA甲基化调节剂，Ying等[24]研究发现UHRF1的过表达增加RGS2启动子的高甲基化，使得RGS2表达水平被抑制，诱导了膀胱癌T24细胞的增殖。DLG5属于膜相关鸟苷酸激酶（MAGUK）家族，是维持细胞极性和细胞连接的重要蛋白，同时也参与前体细胞分裂，细胞增殖，细胞迁移和侵袭以及细胞外信号转导等过程[25]，膀胱癌中Dlg5基因启动子的超甲基化可直接导致Dlg5表达沉默，膀胱癌T24和RT112细胞侵袭能力显著增强，肿瘤转移到肺部的数目也有所增加[26]。另外有学者[27]在膀胱癌中也证实了抑癌基因CREB3L1启动子超甲基化，超甲基化使得CREB3L1的表达水平下降，从而促进了肿瘤细胞的迁移和扩散。由此可见，基因的的异常高甲基化会导致基因的表达水平下降甚至沉默，从而影响膀胱肿瘤细胞的生物学行为，与膀胱癌的发生、发展有着密切的联系。

2.2基因低甲基化与膀胱癌

MMP2是主要的基质金属降解蛋白酶，在胚胎发育、器官形态形成和伤口愈合等生理过程中起重要的作用，也与肿瘤的发生密切相关[28]，血管生成素（ANG）是一种分泌型生长因子，它是第一个人类肿瘤衍生的蛋白，可刺激血管生长，在膀胱癌RT112细胞中敲低ANG的表达后，DN-MT3b的表达提高了25%，而另一方面通过siRNA沉默DNMT3b后，MMP2启动子呈现低甲基化状态，MMP2的表达水平升高，由此Rafael等[22]人认为ANG调节甲基化转移酶DNMT3b的活性，使MMP2基因处于低甲基化，从而促进膀胱肿瘤的发生。LINE-1基因即长散布重复元件1(longinterspersedre-peatedelement-1,LINE-1），尽管在正常组织中LINE-1通常被高甲基化，但LINE-1基因在膀胱癌中已被证实低甲基化，激活致癌基因MET，进而促进膀胱癌的发生[29]。Nüsgen等[30]也观察到按照LINE-1的低甲基化水平进行分级，其中膀胱癌的低甲基化程度最高，其次是前列腺癌，结肠癌和胃癌。DNA低甲基化是多因素的过程，影响的因素有DNA甲基转移酶、DNA损伤修复、表观遗传学调节因子、环境因素及甲基代谢相关基因等方面。而基因的DNA低甲基化会导致沉默基因的激活，染色体不稳定性增加，遗传印记的丢失。DNA低甲基化导致的癌基因的表达水平升高亦是膀胱癌易感性的机制之一。

3、DNA甲基化的临床应用

3.1DNA甲基化与膀胱癌的诊断

液体活检是一种用于发现生物标志物的非侵入性诊断方式，这种无创的检查方法能够减少患者的痛苦，减轻患者的负担。Judith等[31]收集72名膀胱癌患者和75名健康者的尿液，使用甲基化特异性PCR检测尿液中14个基因的甲基化水平，发现膀胱癌患者的尿液中有10个基因出现明显高甲基化，并采用多变量逻辑回归分析最佳标记物组，最终确定GHSR/MAL组合显示出最佳诊断性能，灵敏度达到92%(95%CI:86-99），特异性为85%(95%CI:76-94），这项研究由此发现了一种新的双基因组合，对膀胱癌具有很高的诊断价值，有望应用于非侵入性尿液检测。Bayram等[32]对65名膀胱癌患者和35名没有任何癌症病史的健康者进行了研究，检测肿瘤组织和尿液样品中的CDH1和p14ARF基因的甲基化情况，发现膀胱癌患者的肿瘤组织样品中CDH1和p14ARF基因的甲基化频率分别为95.4%和78.5%，尿液样本中CDH1基因的甲基化频率为68.8%,p14ARF基因的甲基化频率为72.9%，而健康患者尿液样本中CDH1和p14ARF基因的甲基化频率分别为5.7%和37.1%。LIN等[33]提取了42名膀胱癌患者和36名健康者的血清，分析血清中p16和DAPK基因的甲基化情况，结果显示42例患者中有17例（40.5%)p16基因高甲基化，27例（64.3%)DAPK基因高甲基化，两种基因同时都被高甲基化的有12名患者（28.6%），在低级别（G1）膀胱癌患者中观察到更高频率的DAPK基因甲基化（P=0.046），检测非侵袭性膀胱癌患者血液中DAPK和p16基因的甲基化情况可能为早期诊断恶性肿瘤提供有效手段。DNA甲基化基因已被作为诊断癌症的潜在生物标记物，尽管在特异性和敏感性方面还有许多欠缺和不足，但随着研究的深入，DNA甲基化将会成为诊断癌症的常规手段之一。

3.2DNA甲基化与膀胱癌的治疗

抑癌基因的启动子区域发生高甲基化而失去了活性，继而导致癌症的发生，所以用有效的药物抑制DNA甲基化或者逆转DNA甲基化，重新激活肿瘤抑癌基因，这可能是预防和治疗癌症新的策略。

5-Aza是种高效的DNA甲基转移酶抑制剂，Wang等[34]研究发现肿瘤抑制基因hepaCAM（肝细胞粘附分子）在三种膀胱癌细胞中高度甲基化，经用5-氮杂胞苷处理后，hepaCAM基因的表达显著增加，明显抑制了膀胱肿瘤细胞的增殖。Wu等[35]用低剂量地西他滨与顺铂或吉西他滨联合处理膀胱癌小鼠模型，显示出比单独使用任何一种药物更好的抗肿瘤效果，而在地西他滨处理的膀胱癌5637细胞中，SOCS3启动子的DNA甲基化水平降低，SOCS3的蛋白质水平相应的提高，而SOCS3作为STAT3信号通路的抑制剂，可以抑制肿瘤干细胞的自我增殖能力。Madhura等[36]通过RTPCR和westernblot实验发现膀胱癌细胞中RASSF1A表达的缺失，并利用甲基化特异性PCR实验证实了RASSF1A启动子的高甲基化，进一步用地西他滨处理细胞，观察到RASSF1A的表达量显著增加，致癌基因CYR61和CTGF的蛋白水平显着降低，通过MTT测定和PI染色试验检测到癌细胞增殖明显被抑制以及产生更多的凋亡。Wei等[37]用山奈酚处理构建好的膀胱癌模型裸鼠，与对照组相比，实验组裸鼠的肿瘤体积变小，进一步用山奈酚处理T24和5637细胞，结果发现DNMT3b的显着下调，具有低毒性的天然产物山奈酚可能是治疗膀胱癌的新型DNMT3b抑制剂。尽管DNA甲基化转移酶抑制药物逆转了抑癌基因的高甲基化状态，抑制了甲基化转移酶的表达，在治疗膀胱癌中起到了重要的作用，但临床效果尚未见报道，药物疗效还需进一步研究。

3.3DNA甲基化与膀胱癌的预后

膀胱癌是泌尿系统肿瘤中复发率最高的恶性肿瘤，非肌肉浸润性膀胱癌患者的复发率高达50%～80%[3]，虽然病理分期是反映肿瘤的进展，判断预后的重要指标，但是因为生物学异质性，处于同一阶段的患者的临床结局通常会有所不同，因此基于分子生物学的预后评估可以指导个体化治疗并提高治疗效果。

Yang等[38]利用R软件和多变量Cox回归分析TCGA数据库中提取的数据，发现了七个基因是膀胱癌独立的预后指标，构建预后风险模型，根据甲基化水平的高低对应分为高风险组和低风险组，生存分析证实低风险组患者的预后明显优于高风险组。Marzieh等[39]收集80例膀胱癌患者的组织样本，通过MS-PCR方法检测发现有36例（45%）膀胱癌患者存在MGMT基因甲基化。在随访期间，27例复发患者中有25例（92.5%）显示MGMT基因高甲基化。临床病理分析显示组织样本中MGMT基因高甲基化与分级无明显相关性，但MGMT基因高甲基化与肿瘤的复发（OR=3.43,95%CI=2.11-5.71,P=0.0000）和转移（OR=2.09,95%CI=1.38-3.18,P=0.0003）有显著相关性。肿瘤抑制基因钙粘蛋白11(CDH11）的启动子区域的高甲基化经常发生在人类癌症中，LIN等[40]通过对146个膀胱癌组织中CDH11的甲基化状态进行检测，发现63.0%(92/146）的膀胱癌组织中检测到异常的CDH11启动子高甲基化，进一步分析CDH11的甲基化状态与临床病理特征相关性，结果表明CDH11甲基化与分级（P=0.0440），分期（P=0.0350），肿瘤大小（P=0.0013）显著相关，多变量Cox比例风险分析结果也表明CDH11甲基化与膀胱癌患者的预后不良独立相关。有荷兰研究者纳入192名pTaG1/2期的膀胱癌患者，进行甲基化分析并使用对数秩检验来计算每种甲基化标记物随时间而发展的预测值，与10年随访期间所有标记物的高甲基化率患者相比，甲基化率低的患者的无进展生存期更好，而TBX2,TBX3是肿瘤进展的独立预测因子，根据TBX2和TBX3的甲基化状态，将患者分为三个新的分子级组，生存分析显示，相较于中等和高分子等级组（29%,63%）,低分子量组中在5年内肿瘤进展的患者只有8%,此研究为评估TaG1/G2期膀胱肿瘤患者的进展风险提供了有价值的标记物[41]。以上研究表明众多基因对膀胱癌的预后监测有一定的效果，可以作为膀胱癌术后复发的预测指标。

4、展望

DNA甲基化在膀胱癌的发生和发展过程中扮演者越来越重要的角色，DNA甲基化可导致有些抑癌基因表达水平降低或者是功能的失活，减弱抑癌基因对膀胱癌的抑制作用。我们现通过甲基化敏感的限制性内切酶技术，DNA序列分析检测技术以及质谱分析和甲基化芯片检测技术，可以找出膀胱癌中甲基化异常的基因，从而确立膀胱癌特异性的DNA甲基化谱，为膀胱癌的诊治和预后评估等方面开拓了新的思维方式。随着DNA甲基化的深入研究，膀胱癌诊治和预后等各方面虽然取得了一定的成绩，但是也存在着诸多问题。比如DNA甲基化诊断的特异性和敏感性仍有待提高，DNA甲基化抑制药物在种类和功能上还有所欠缺，相信随着科研技术的进步，能找到更具特异性和敏感性的甲基化基因有助于膀胱癌的早期诊断，能发现更多有效的药物预防或者逆转甲基化，为膀胱癌的诊治提供新的策略。

参考文献:

[2]陈晓芳,陈万青,周薇薇,等.2013年中国膀胱癌发病和死亡流行状况分析[J].中国肿瘤,2018,27(02):81-85.

[11]王全玉,何炜,蔺强,等.膀胱癌组织中DNMT蛋白表达水平与肿瘤增殖和凋亡程度的相关性[J].现代肿瘤医学,2015,23(13):1855-1858.

朱理,汪翼.DNA甲基化与膀胱癌关系的研究进展[J].西南军医,2020,22(05):424-428.

基金:衡阳市科学技术发展计划项目(项目编号:2018KJ135);湖南省教育厅重点项目(项目编号:16A188).