乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，其发病率逐年上升[1]。尽管近年来，乳腺癌的治疗包括手术、化疗、放疗、内分泌以及靶向治疗取得了很大的进步，但是其死亡率仍居高不下。我国女性乳腺癌的发病和死亡人数预计将持续上升，至2030年将分别增加36.27%和54.01%,我国老年女性乳腺癌发病数和死亡数预计将分别增加40%和52%[2]。因此乳腺癌的防治和机制研究对于提高乳腺癌患者的生存期具有非常重要的意义。

中医药是我国恶性肿瘤治疗的特色和优势，在乳腺癌的综合治疗中发挥着重要的作用。西黄丸作为中医药治疗乳腺癌的经典方药首载于《外科全生集》,是清代著名医家王洪绪所创，迄今应用有近300年的历史。西黄丸由乳香、没药、牛黄、麝香四味组成，具有清热解毒、消肿散结的作用，传统用于热毒壅结所致痈疽疔毒、瘰疬、流注、癌肿等[3]。现代主要用于恶性肿瘤及各种感染性疾病，以及某些证属痰火热毒积聚的疑难杂症。西黄丸临床应用于恶性肿瘤的治疗可改善症状，提高生活质量、降低复发转移、延长生存期等[4-5]。基础研究也证实西黄丸可以抑制肿瘤的生长转移，其作用包括直接抑制肿瘤细胞的增殖、抑制血管新生、抑制基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9,MMP9)的表达等[6-9]。但是其具体的作用机制目前尚不明确，本研究选用具有高度转移能力，与人晚期乳腺癌生物学行为具有很高相似性的小鼠炎性乳腺癌4T1为研究模型，观察西黄丸对乳腺癌生长的影响，同时以骨髓来源免疫抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)为切入点探讨西黄丸调节荷瘤机体免疫功能的机制，为西黄丸治疗乳腺癌的临床应用提供进一步的实验依据。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物与细胞

雌性BALB/C小鼠，6～8周龄，体质量(20±2)g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：医动字01-3001。自适应喂养1周后开始实验。所有实验均获得中国中医科学院广安门医院实验动物伦理委员会批准。乳腺癌4T1细胞株由美国国立癌症研究所分子免疫调节实验室惠赠，保存于广安门医院肿瘤实验室。

1.1.2药物与试剂

实验用药西黄丸购自同仁堂有限公司，药品批号：16042921;RPMI Medium1640培养液，美国Gibco公司；胎牛血清，美国Gibco公司；0.25%胰蛋白酶，美国Gibco公司；磷酸盐缓冲溶液(PBS),美国CORNING公司；红细胞裂解液，美国BD Pharminge; 4%的多聚甲醛固定剂，中国索莱宝公司；水合氯醛，美国默克公司；小鼠CD3(PerCP)、CD8(PE)、CD45(FITC)、CD11b(PE)、Gr1(APC)、IFN-γ(APC),Leuko Act Cktl With GolgiPlug,美国BD Pharminge; IL-1β、IL-6、MCP-1 lumi luminex多因子检测试剂盒，R&D;ROS检测试剂盒，中国索莱宝公司。

1.1.3主要仪器

倒置显微镜，日本尼康公司；细胞培养超净台，苏州净化；二氧化碳培养箱，日本三洋公司；低温高速离心机，德国Eppendorf公司；Luminex200,美国Luminex公司；FACS Calibur流式细胞仪，美国BD公司。

1.2实验方法

1.2.1小鼠4T1乳腺癌模型建立

常规复苏4T1乳腺癌细胞，采用RPMI 1640培养基培养至对数生长期，选取生长在对数期的细胞，胰酶消化后，预冷的PBS洗涤3次，显微镜下计数活细胞数，加入0.9%预冷的PBS将其制备成2×106cell/mL乳腺癌细胞悬液，75%的酒精消毒，每只小鼠0.1 mL接种于BALB/C小鼠右侧第四对乳垫下。接种后小鼠自由进食、进水。

1.2.2实验分组及给药

西黄丸临床成人用药剂量为6 g/d,根据小鼠与人用药换算确定小鼠等同剂量为0.9 g/kg。小鼠接种肿瘤细胞后第二日称重，随机分为5组，每组10只，分别为：模型组(Model);环磷酰胺组(CTX)(60 mg/kg);西黄丸0.9 g/kg高剂量组(XHP-high)、0.6 g/kg中剂量组(XHP-mid)、0.3 g/kg低剂量组(XHP-low)。CTX组分别于肿瘤细胞接种后第一天、第七天给予腹腔注射CTX 60 mg/kg,模型组每日给予生理盐水0.2 mL。西黄丸各剂量治疗组连续灌胃给药21 d,小鼠脱颈处死，留取小鼠血液、剥出瘤块称重并计算抑瘤率，抑瘤率=(对照组瘤质量-实验组瘤质量)/对照组瘤质量×100%。

1.2.3流式细胞仪检测法

外周血：每只小鼠称重后，采用眼球取血法，收集血液至含抗凝剂的收集管内；取100μL血液，分别加入CD11b、Gr1抗体，4℃孵育30 min,加入2 mL红细胞裂解液混匀，室温裂解10 min, 1 200 r/min离心5 min。弃去上清，再次重复上述过程后，加入预冷PBS重悬细胞，上机检测。

小鼠脾脏：收集小鼠脾脏称重后，加预冷含有2%小牛血清的PBS洗涤，分别剪去筋膜和脂肪组织，注射器针芯研磨，200目筛网过滤，收集细胞悬液，5 min, 1 300 r/min。离心后，弃上清，红细胞裂解液去除红细胞后，洗涤、重悬细胞于PBS中，将细胞浓度调整为107个/mL,取100μL细胞悬液，根据需要加入不同抗体，4℃孵育30 min洗涤，加入预冷PBS重悬细胞，上机检测。其中小鼠脾脏细胞IFN-γ 的检测按照胞内细胞因子的检测方法进行，包括刺激、表面抗体染色、破膜、胞内细胞因子染色等步骤。

小鼠骨髓：用眼科剥离剪下小鼠大腿骨，同时剪去两端软骨，露出红色的骨髓腔。采用1 mL的无菌注射器，每支吸取1 mL预冷的PBS,轻轻插入骨髓腔，冲洗骨髓腔，获取的骨髓用200目的滤网过滤，收集细胞悬液，离心洗涤。红细胞裂解液后，洗涤、重悬细胞于PBS中。将细胞浓度调整为107个/mL,取100μL细胞悬液，分别加入CD11b、Gr1抗体，4℃孵育30 min, PBS洗2遍后，加入预冷PBS重悬细胞，上机检测。

1.2.4细胞因子的检测

采用Luminex200系统测量血清样品的细胞因子表达水平，包括IL-1β、IL-6、MCP-1,使用Luminex200 ISV2.1软件从平均荧光强度获得浓度值，标准曲线由参考细胞因子梯度浓度生成，根据标准曲线计算样品中细胞因子的浓度。

1.2.5小鼠脾脏细胞ROS检测

荷瘤小鼠脾脏制备成单细胞悬液，按照1∶1 000用无血清培养液稀释DCFH-DA,使终浓度为10μmol/L,加入细胞106/mL,37℃细胞培养箱内孵育20 min后，用无血清细胞培养液洗涤3次。流式细胞仪激发波长488 nm检测。

1.2.6统计学方法

所得计量资料以均数±标准差

表示，数据分析采用SPSS 26.0统计分析，多组间样本均数比较采用单因素方差分析(One-way-ANOVA),进一步两组间样本比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1西黄丸对4T1乳腺癌生长的抑制作用

BALB/C小鼠在接种4T1细胞后4 d左右出现肉眼可测量病灶，给予荷瘤小鼠不同剂量西黄丸治疗21 d后称重肿瘤，西黄丸0.9、0.6、0.3 g/kg各剂量治疗组均显示了一定的抑制肿瘤生长的作用，与模型组比较，差异均具有统计学意义(P<0.01或P<0.05),其中以0.9 g/kg组抑制作用最为明显，抑瘤率达到40%(表1)。

表1西黄丸对4T1乳腺癌移植瘤生长的影响

2.2西黄丸对4T1荷瘤小鼠MDSCs的影响

于小鼠接种4T1肿瘤细胞后的第21 d,采用流式细胞仪分别检测荷瘤小鼠脾脏、外周血、骨髓组织MDSCs的比例，结果显示模型组荷瘤小鼠脾脏、外周血、骨髓组织MDSCs比例相比较正常组小鼠显著升高，西黄丸干预组小鼠外周血、脾脏、骨髓组织MDSCs比例降低，和模型组相比较差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05,图1)。

2.3西黄丸对4T1荷瘤小鼠脾脏ROS的影响

MDSCs可以释放产生高水平的ROS,导致T细胞的失活从而抑制抗肿瘤免疫。小鼠接种4T1肿瘤细胞后的第21天时，小鼠脾脏增大，其中占主要比例的为MDSCs。因此本研究采用流式细胞仪对荷瘤小鼠脾脏的ROS进行检测，结果显示，西黄丸可显著降低荷瘤小鼠脾脏ROS的水平，和模型组比较具有显著的意义，其中模型组：784.33±86.52,西黄丸治疗组：437.67±71.57(P<0.01,图2)。

2.4西黄丸对4T1荷瘤小鼠脾脏CD8+IFN-γ+的影响

流式细胞仪对荷瘤小鼠脾脏CD8+T细胞和检测分析如图3所示，模型组荷瘤小鼠在21 d时其脾脏CD3+细胞和CD3+CD8+T细胞均有所降低， 平均为脾脏淋巴细胞的(13.27±1.19)%和(4.09±0.38)%,西黄丸可 提高荷瘤小鼠脾脏CD3细胞和CD8细胞的比例，分别为(18.73±1.80)%和(6.56±0.54)%,与对照组比较具有显著意义(P<0.05)。IFN-γ是CD8细胞发挥抗肿瘤免疫的主要因子，进一步对CD8+T中IFN-γ阳性的细胞比例进行分析，结果显示，西黄丸可显著提高荷瘤小鼠IFN-γ+细胞的比例(P<0.05,图3)。

2.5西黄丸对荷瘤小鼠IL-1β、IL-6的影响

MDSCs的扩增、活化受体内多种细胞因子的调控，本研究采用Luminex液相芯片技术对荷瘤小鼠外周血IL-1β、IL-6、MCP-1的浓度进行了检测，结果显示小鼠在接种4T1的21 d,外周血IL-1β、IL-6、MCP-1的表达较正常小鼠具有显著的升高，给予西黄丸干预后荷瘤小鼠体内IL-1β、IL-6明显下降，而MCP-1的表达虽有下降的趋势，但和模型组相比不具有统计学差异(图4)。

3、讨论

MDSCs是一群异质性细胞，包括多种处于不同分化阶段的髓样细胞，如髓系祖细胞、未成熟的巨噬细胞、粒细胞、单核细胞、树突状细胞等。MDSCs可通过抑制机体抗肿瘤免疫、影响上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transtition EMT)、侵袭、血管生成、转移前小生境形成等多种途径促进肿瘤发生发展乃至转移，也是目前免疫治疗疗效难以达到期望的重要障碍[10]。小鼠MDSCs的膜表面表达Gr1和CD11b分子，人MDSCs根据其细胞单核比例分为PMN-MDSCs(CD14-CD11b+CD33b+CD15+)和M-MDSCs(CD14+HLA-DR-)[11]。在荷瘤小鼠的血液、脾脏及肿瘤组织和肿瘤患者的外周血及肿瘤组织中存在大量MDSCs的扩增，与多种实体瘤包括乳腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、肝癌等肿瘤的进展转移密切相关[12-13]。因此抑制MDSCs的生成、功能活化对于恶性肿瘤的进展具有非常重要的意义。

图1西黄丸对4T1荷瘤小鼠MDSCs比例的影响(n=4)

图2西黄丸对4T1荷瘤小鼠脾脏细胞ROS表达的影响(n=3)

目前针对MDSCs的干预措施有多种，包括小剂量化疗药物如吉西他滨、5-氟尿嘧啶的直接杀伤作用；采用NO抑制剂、精氨酸酶抑制剂、ROS抑制剂等阻断其功能，恢复机体抗肿瘤免疫；促进MDSCs的分化成熟等[14],但是这些治疗的措施尚没有取得令人满意的效果。因此近年来从天然药物中寻找作用于MDSCs的研究越来越受到大家的关注[15]。有研究[16]报道绿茶中的多酚类物质可以抑制MDSCs的趋化和肿瘤组织的浸润。姜黄的有效成分姜黄素可以抑制多种肿瘤的生长，同时在小鼠恶性黑色素瘤、肺癌模型中观察到其可通过调控炎性因子IL-6介导的信号通路减少MDSCs的增殖和活化，改善其免疫抑制功能[17-18]。ZHOU等[19]报道中药淫羊藿中的有效成分淫羊藿苷能够直接作用于MDSCs并促进其分化成熟为树突状细胞、巨噬细胞。采用Lewis肺癌荷瘤小鼠研究发现黄连素能够增加肿瘤细胞PD-L1的降解，从而增加肿瘤组织T细胞的浸润并伴随MDSCs的减少[20]。炎症因子被认为是荷瘤机体MDSCs扩增活化的主要机制，清热解毒法是中医药治疗恶性肿瘤的主要法则，现代药理研究也表明抑制炎症是清热解读方药发挥作用的机制之一，作为清热解毒代表方的传统古典名方西黄丸在恶性肿瘤的治疗中有明确的优势，因此本研究通过观察西黄丸对MDSCs的影响，从而为从清热解毒类方药中开发高效、副作用少的MDSCs干预药物提供一定的基础。

图3西黄丸对4T1荷瘤小鼠脾脏细胞CD8+IFN-γ+表达的影响(n=3)

图4西黄丸对4T1荷瘤小鼠细胞因子表达的影响(n=3)

本研究首先构建小鼠炎性乳腺癌4T1模型，4T1是一株生物学行为与人乳腺癌表现非常相似的肿瘤，随着肿瘤的生长，其外周血、脾脏、淋巴结、骨髓、肿瘤组织聚集大量的免疫抑制细胞MDSCs,促进肿瘤的发展及转移，是MDSCs相关研究的理想模型。在肿瘤细胞接种21 d时检测荷瘤小鼠外周血、脾脏、骨髓中MDSCs的比例均较正常组小鼠有显著的升高，与文献报道一致[21]。给予西黄丸干预21 d后，结果显示西黄丸不同剂量均具有一定的抑制肿瘤生长的作用，同时西黄丸高剂量干预后荷瘤小鼠无论是外周血、脾脏还是骨髓中MDSCs的比例均有不同程度的下降，说明西黄丸对MDSCs具有一定调控作用。免疫抑制是MDSCs的主要特征，其可通过释放高水平的ROS降低TCRζ链的表达，导致T细胞失活，阻断CD8+T细胞的抗原特异性反应[22-23]。因此本研究进一步对荷瘤小鼠脾脏细胞ROS、CD8+T比例以及其发挥杀伤功能相关IFN-γ的分泌进行检测，结果显示西黄丸可显著降低ROS水平，且CD8+T、IFN-γ+比例明显高于模型对照组，说明西黄丸在抑制MDSCs扩增的同时提高荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫功能。

MDSCs增殖活化是个非常复杂的过程，目前研究认为这一过程与肿瘤以及微环境中基质细胞分泌的炎性介质密切相关，包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、IL-6、IL-1β、肿瘤坏死因子-a(tumor necrosis factor-alpha, TNF-a)等，这些因子刺激骨髓以及淋巴器官的未成熟祖细胞发育分化障碍生成MDSCs,并在趋化因子及其受体的调控下迁徙到肿瘤组织、脾脏、淋巴结等。MDSCs在肿瘤微环境的增殖活化仍然依靠细胞因子的调控，包括IL-1β、IL-6、IL-4等[23]。除了肿瘤细胞外，活化后的MDSCs也可通过分泌大量的细胞因子，尤其是IL-1β和IL-6刺激自身的增殖和功能的发挥[24]。因此本研究同时检测了与MDSCs增殖、迁徙、活化密切相关的荷瘤小鼠外周血IL-6、IL-1β、MCP-1的水平，结果发现西黄丸可显著降低IL-6、IL-1β的水平，MCP-1的表达虽有下降的趋势，但和模型组相比不具有统计学差异。

综合以上结果，西黄丸可通过减少MDSCs比例，增强荷瘤小鼠抗肿瘤免疫功能从而抑制小鼠4T1炎性乳腺癌的生长，其调控MDSCs的增殖以及功能的活化的机制与降低细胞因子IL-6、IL-1β可能有关，深入的作用机制还需要进一步的探索。

参考文献:

[2]何思怡,李贺,曹毛毛,等.全球及我国女性乳腺癌疾病负担年龄分布及变化趋势[J].中国肿瘤,2023,32(1):1-7.

[3]郭秋均,李丛煌,花宝金.西黄丸治疗恶性肿瘤的进展和展望[J].环球中医药,2015,8(08):998-1002.

[8]张志莹,胡凯文.西黄丸抗肿瘤的基础研究进展[J].世界中西医结合杂志,2020,15(09):1761-1764.

[9]刘艳之,王艳,刘凯丽.西黄丸对H(22)荷瘤小鼠的抑瘤作用及其机制研究[J].中国临床药理学与治疗学,2022,27(07):754-761.

[13]李宝华,孙晋,张晨,等.髓系来源的抑制性细胞在小鼠H22原位种植性肝癌中的表达及其意义[J].现代肿瘤医学,2020,28(09):1419-1425.

基金资助:国家自然科学青年科学基金项目(编号:81603567);

文章来源:樊慧婷,祁鑫,关念波,等.西黄丸抑制乳腺癌4T1荷瘤小鼠生长的作用及其机制[J].现代肿瘤医学,2024,32(20):3828-3833.