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GLP-1类似物对糖尿病合并代谢相关脂肪性肝病自噬的影响

2024-05-28 68 上传者：管理员

摘要：目的探讨利拉鲁肽是否可以通过增加自噬减轻2型糖尿病(T2DM)合并代谢相关脂肪性肝病(MAFLD)肝细胞脂肪变性、调节糖脂代谢。方法采用随机数字表法将大鼠分为正常对照(NC)组和T2DM组，分别予以普通饲料及高糖高脂饲料喂养，9 w后，对所有大鼠进行腹部超声检查，超声检查提示均为脂肪肝，随机抽取3只大鼠处死，取出肝脏进行苏木素-伊红(HE)染色，观察病理切片为肝脏脂肪变性，诊断为MAFLD,对MAFLD大鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ)30mg/kg制备T2DM合并MAFLD动物模型，造模成功后，将大鼠分为生理盐水组(HF组)、利拉鲁肽组(LIR组，100μg/kg每日两次)及利拉鲁肽+氯喹组(LIR+CQ组，LIR 100μg/kg每日两次，CQ 50 mg/kg,每3 d一次),干预4 w,抽取空腹静脉血检测以下指标：空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST);取肝脏标本进行HE染色观察肝细胞内脂质沉积情况；Western印迹及实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)方法检测大鼠肝组织自噬相关指标如微管相关蛋白1轻链(LC)3Ⅱ、Beclin-1、自噬相关基因(Atg)5、Atg7 mRNA及蛋白的表达。结果 LIR组较HF组相比，肝组织脂肪变性减轻，FBG、FINS、HOMA-IR、TG、TC、LDL-C、AST、ALT水平下降，HDL-C水平升高，自噬相关因子LC3Ⅱ、Beclin-1、Atg5、Atg7mRNA及蛋白的表达增加；LIR+CQ组肝组织呈弥漫脂肪变性，与LIR组相比，FBG、FINS、HOMA-IR、TG、TC、LDL-C、AST、ALT水平增加，HDL-C水平下降，自噬相关因子LC3Ⅱ、Beclin-1、Atg5、Atg7mRNA及蛋白下降。结论利拉鲁肽可通过激活自噬水平，对T2DM合并MAFLD大鼠肝脏脂质沉积及糖脂代谢起保护作用。

关键词：
2型糖尿病
代谢相关脂肪性肝病
糖脂代谢
肝脏脂肪变性
自噬
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非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指在缺乏脂质累积相关继发原因(包括过度饮酒、致脂质沉积的药物)的情况下，组织学或影像学水平检测到肝脏脂肪变性，可从伴有或不伴有炎症的轻度脂肪变性演变为伴有炎症浸润和肝细胞损伤的脂肪变性。2020年来自不同国家的专家小组将NAFLD重新命名为代谢相关脂肪性肝病(MAFLD),MAFLD通常与肥胖、高脂血症和胰岛素抵抗等代谢紊乱相关疾病有关，并可进一步增加心血管疾病、2型糖尿病(T2DM)和慢性肾脏病的风险[1]。T2DM与MAFLD两种疾病有密切的相关关系，MAFLD会增加T2DM及其并发症的风险，而T2DM也会增加MAFLD及其并发症的严重程度。一项meta分析显示，MAFLD患者中T2DM的患病率达22.51%[2]。而在肝酶正常的T2DM患者中，MAFLD有高达50%的患病率[3]。这说明T2DM和MAFLD之间存在双向作用关系，两疾病可能促进彼此的发生进程。此外，胰岛素抵抗共同参与MAFLD与T2DM的发生发展[4]。

自噬是细胞内自我降解途径之一，可将胞内蛋白质和细胞器转运至溶酶体进行降解，还在调节细胞能量和营养储存方面起着关键作用[5]。研究显示，自噬可以选择性地降解肝细胞中累积的脂质[6]。Zhou等[7]研究显示，在T2DM大鼠中，通过使用自噬激活剂雷帕霉素激活自噬，可明显改善其胰岛素抵抗和肝脏脂肪变性，缓解糖脂代谢紊乱。这说明自噬在T2DM及MAFLD中均可发挥保护作用。胰高血糖素样肽-1类似物(GLP-1)类似物是肠道L细胞分泌的肠源性激素，可以通过调节葡萄糖的摄取和胰岛素的合成，抑制胰岛β细胞的凋亡和延缓胃排空等多重效应改善T2DM症状，被广泛应用于T2DM的治疗。GLP-1类似物在改善MAFLD中也显示出一定的潜力，一项荟萃分析提示GLP-1类似物可以有效地降低肝酶，改善肝脏炎症、肝脏脂肪变性和纤维化，并可以在一定程度上逆转肝脏纤维化[8]。Armstrong等[9]对非酒精性脂肪型肝炎患者予以利拉鲁肽治疗48 w后，体质量和糖化血红蛋白(HbA1c)明显改善，39%的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者肝炎得到了缓解，并且与安慰剂组相比，接受利拉鲁肽治疗组的患者纤维化程度降低。本研究探索利拉鲁肽是否通过激活自噬从而改善T2DM合并MAFLD。

1、材料和方法

1.1材料

利拉鲁肽购自诺和诺德公司，链脲佐菌素(STZ)购自索莱宝公司，血糖仪及试纸购自达乐公司，胰岛素试剂盒、三酰甘油(TG)试剂盒、总胆固醇(TC)试剂盒、谷丙转氨酶(ALT)试剂盒、谷草转氨酶(AST)试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒均购自南京建成公司，微管相关蛋白1轻链(LC)3Ⅱ抗体(43566T)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(D16H11)购自cell signaling公司，自噬相关基因(Atg)5抗体(ab108327)、Atg7抗体(ab133528)、Beclin-1抗体(ab207612)购自abcam公司，羊抗兔二抗购自索莱宝公司，Trizol试剂购自宝日医生物技术公司，聚合酶链反应(qPCR)反转录试剂盒(FSQ-301)及实时荧光定量(RT)-qPCR染料SYBR(QPK-201)均购自东洋纺公司。

1.2模型制备

31只SPF级雄性Wistar大鼠，5周龄，体质量160～180 g(购自北京斯贝福),于SPF级动物房中分笼饲养，适应性喂养1 w,采用随机数字表法将大鼠随机分为正常对照(NC)组(7只)和MAFLD组(24只),NC组予以普通饲料喂养，MAFLD组予以高糖高脂饲料(每100 g的配比：奶粉含量10 g、猪油含量13 g、蛋黄含量10 g、白糖含量7 g、普通饲料含量60 g及浓缩鱼肝油10滴)喂养，自由进水，第9周后对大鼠进行腹部超声检查，超声提示均为脂肪肝，并随机抽取3只大鼠处死取出肝脏制备病理切片观察肝脏脂质沉积情况，MAFLD组大鼠诊断为脂肪肝，并将其麻醉后取出肝脏，生理盐水漂洗后，取部分肝脏固定于4%多聚甲醛中，制作病理切片，苏木素-伊红(HE)染色后在光镜下随机选取3个不同视野，有33%以上的肝细胞脂肪变时诊断为MAFLD造模成功，禁食8 h后，腹腔注射STZ 30 mg/kg, 72 h后，尾静脉取血测随机血糖≥16.7 mmol/L,说明T2DM合并MAFLD模型制备成功。

1.3给药方式

将T2DM合并MAFLD模型大鼠分为生理盐水组(HF)7只，利拉鲁肽(LIR)组7只，利拉鲁肽+氯喹组(LIR+CQ)7只，LIR组每日腹部皮下注射利拉鲁肽100μg/kg两次，LIR+CQ组在利拉鲁肽干预的基础上，每3 d腹腔注射一次CQ(50 mg/kg),干预4 w。每周一固定时间称取并记录大鼠体质量。

1.4血液生化指标的检测

禁食后次日清晨，称取大鼠体质量，尾静脉取血检测空腹血糖(FBG),10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，开腹，腹主动脉取血4 ml,室温静置15 min后3 000 r/min离心15 min,全自动生化分析仪检测血清空腹胰岛素(FINS)、TG、TC、HDL-C、LDL-C、ALT、AST。计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。

1.5肝脏HE染色及电镜观察大鼠肝脏自噬情况

横切部分肝组织于10%中性甲醛溶液中进行固定，经脱水、脱蜡、包埋、切片等步骤后进行HE染色，光镜下观察拍照。取大鼠肝组织，生理盐水冲洗干净，取1 mm3大小肝组织固定于2.5%戊二醛溶液中，4℃冰箱保存，送至北京中科百测公司电镜中心进行透射电镜检测，拍照并观察大鼠肝组织中自噬小体。

1.6 Western印迹法检测肝组织中自噬相关蛋白的表达

取0.1 g肝组织于液氮中研磨，加入RIPA蛋白裂解液[按比例加入苯甲基磺酰氟(PMSF)],与组织混匀后，存放于新的无菌离心管中，按试剂盒步骤提取组织蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)试剂盒测定蛋白浓度，将适量蛋白与相应体积上样缓冲液混匀，100℃水浴锅中变性5 min。样本加至十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中进行电泳，蛋白经湿转法转至聚偏氟乙烯(PVDF)上，TBST溶液与脱脂奶粉配制5%的封闭液，将PVDF膜置于封闭液中，室温摇床封闭1 h,目的蛋白置于一抗LC3Ⅱ、Beclin-1、Atg5、Atg7(1∶1 000)、内参蛋白于GAPDH(1∶1 000)中4℃孵育过夜。取出条带，TBST洗涤3次后，加入二抗稀释液(1∶5 000),室温摇床孵育1 h,使用TBST洗涤3次，电化学发光(ECL)法使条带显色，条带拍照后，Image J软件对条带进行灰度分析。

1.7 RT-qPCR法检测肝脏自噬相关因子mRNA的表达

取0.1 g肝脏组织，加入液氮进行研磨，使用Trizol法进行肝脏总RNA的提取，使用紫外分光光度计检测所提取RNA的浓度和纯度，按反转录试剂盒步骤将RNA反转录为cDNA,然后对cDNA进行扩增，以GAPDH作为内参基因，每个样本做3个复孔，扩增后的CT值以2-ΔΔCt计算相对表达量。引物由上海生工公司合成，具体序列(5′-3′)为GAPDH上游：GCAAGAGAGAGGCCCTCAG,下游：TGTGAG-GGAGATGCTCAGTG;LC3Ⅱ上游：TTATAGAGCGATACAAGGGGGGAG,下游：CGCCGTCTGATTATCTTGATGAG;Atg5上游：CAATCACCAAGACGGAGAG-AAGAAGAG,下游：TGATGTGAAGGAAGTTGTCTGGATAGC;Atg7上游：GATGGTGAACCTCAGCGGATGTATG,下游：CAGCAGCAGGCACTTGACAGAC;Beclin-1上游：CTCTGAAACTGGACACGAGC,下游：CCTGAGTTAGCCTCTTCCTCC。

1.8统计学方法

使用Prism8.0软件进行单因素方差分析。

2、结果

2.1各组超声检测

正常组肝脏回声细密均匀，偏低，肝内管系结构清晰，可见短线样管壁回声，MAFLD组肝脏回声细密增强，欠均匀，肝内管系结构较模糊。见图1。

2.2各组外观情况

NC组体型正常，反应敏捷，皮毛光亮，精神状态好；HF组、LIR组、LIR+CQ组在STZ干预前毛发顺滑有光泽，体形肥胖，精神状态良好；在药物干预后，HF组体质量增长稳定，精神状态良好；LIR组13～15 w体质量较HF组下降，进食减少，精神状态良好；LIR+CQ组反应迟钝，毛发无光泽，第13～15周体质量较HF组下降(P<0.05),第14、15周体质量显著高于LIR组(P<0.05)。见表1。

2.3各组血清生化指标结果

与NC组相比，HF组FBG、FINS、HOMA-IR、ALT、AST、TG、TC、LDL-C显著升高，HDL-C显著下降(P<0.05);与HF组相比，LIR组FBG、FINS、HOMA-IR、TG、TC、LDL-C、ALT、AST显著降低，HDL-C显著升高(P<0.05)。与LIR组相比，LIR+CQ组FBG、FINS、HOMA-IR、TG、TC、LDL-C、ALT、AST显著升高，HDL-C显著下降(P<0.05)。见表1、表2。

2.4各组肝湿重及肝指数

各组肝湿重及肝指数相比，HF组较NC组显著升高(P<0.01);LIR组较HF组显著降低(P<0.01);LIR+CQ组较HF组及LIR组显著升高(P<0.01)。见表2。

图1两组肝脏超声

表1各组不同时间体质量及代谢相关指标比较

0 w体质量为适应性喂养1 w分组后各组大鼠初始体质量，10 w为注射STZ造模前体质量，给药干预4 w体质量为表中11～14 w, 15 w为处死取材前体质量；与NC组比较：1)P<0.05;与HF组比较：2)P<0.05;与LIR组比较：3)P<0.05;下表同

2.5各组肝脏病理切片及电镜下自噬小体

肝组织HE染色中，NC组肝小叶排列清晰，肝细胞结构完整；HF组肝细胞肿胀，呈气球样变；LIR组可见少量脂滴，肝小叶结构完整，肝细胞排列整齐；LIR+CQ组胞质内有大量脂滴。NC组肝细胞中细胞核及细胞质分布均匀，线粒体呈圆形或椭圆形，存在少量自噬小体；LIR组肝组织中自噬增强，可见典型的自噬小体；HF组及LIR+CQ组肝细胞核形态不规则，仅可见极少量自噬小体。见图2。

2.6各组肝组织自噬相关因子mRNA及蛋白的表达

与NC组相比，HF组LC3Ⅱ、Beclin-1、ATG5、ATG7 mRNA及蛋白表达量JEJO降低(P<0.05);与HF组相比，LIR组LC3Ⅱ、Beclin-1、ATG5、ATG7 mRNA及蛋白表达量增加(P<0.05);与LIR组相比，LIR+CQ组LC3Ⅱ、Beclin-1、ATG5、ATG7 mRNA及蛋白表达量明显降低(P<0.05)。见表3。

表2各组生化指标、肝湿重及肝指数比较

图2利拉鲁肽对T2DM合并MAFLD大鼠肝脏病理学影响

表3各组肝组织自噬相关因子mRNA及蛋白水平

3、讨论

MAFLD和T2DM都属于代谢性疾病，一系列代谢相关因素如胰岛素抵抗、糖毒性、脂毒性、遗传及其他因素促进MAFLD及T2DM的发生发展。T2DM的存在会促进MAFLD患者进展为非酒精性脂肪型肝炎、晚期纤维化、肝硬化及肝细胞癌的风险。Younossi等[10]的一项荟萃分析结果提示T2DM合并MAFLD患者中出现中晚期肝纤维化的患病率约为17%。目前生活方式干预是T2DM及MAFLD的一线干预方式。有研究显示，体质量减轻5%～10%在MAFLD患者中即可出现良好的改善效果，然而，超过50%的MAFLD患者未达到减重目标[11],这说明通过改善生活方式很难达到或维持理想的体质量，更凸显了药物治疗的重要性，目前尚无获批药物用于治疗MAFLD的药物，部分降糖药在MAFLD中呈现出一定的效果。利拉鲁肽作为GLP-1类似物的一种，被广泛应用于糖尿病的治疗，临床试验结果显示利拉鲁肽可降低T2DM患者肝脏脂肪含量[12]。GLP-1类似物也可改善饮食诱导的非酒精性脂肪型肝炎小鼠肝脏脂质的积累[13],这与本研究结果一致，即利拉鲁肽可以显著降低高糖高脂饮食诱导的肝脏脂肪变性及血清TG、TC、ALT、AST,说明GLP-1类似物在缓解MAFLD中有一定的潜力，然而，GLP-1类似物治疗MAFLD的潜在分子机制尚未得到充分的研究。

在维持肝脏细胞代谢及能量稳态中，自噬发挥着重要的作用，脂滴等物质被自噬溶酶体吞噬后进行降解，维持脂质代谢平衡，在饥饿条件下，脂滴降解产物游离脂肪酸可通过β氧化为机体提供能量[14,15]。LC3Ⅱ是哺乳动物自噬体膜蛋白标记物，可以反映自噬的变化[16]。Beclin-1是最早发现的哺乳动物自噬蛋白之一，与酵母中Atg6是直系同源物，是自噬机制的核心成分，Beclin-1与囊泡转运蛋白(VPS)34和VPS15共同形成磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)调节自噬体小体的合成和成熟[17]。Atg5和Atg7是两种重要的自噬相关蛋白，可以促进自噬小体的形成[18]。研究显示，在培养的肝细胞中敲除自噬相关基因或使用自噬抑制剂时，可以显著增加肝细胞内脂滴的数量和TG的沉积，而在激活自噬后，肝细胞脂肪变性得到明显的改善[19,20]。这些研究表明，诱导自噬可能是治疗脂肪肝的有效方法。本研究结果说明，高糖高脂饮食可能会减少自噬的表达；利拉鲁肽可以增强自噬的表达，CQ通过抑制自噬降低了利拉鲁肽对T2DM合并MAFLD大鼠的有益作用。

综上所述，利拉鲁肽可以上调LC3ⅡmRNA及蛋白表达量的表达，增强T2DM合并MAFLD大鼠肝脏自噬，改善糖脂代谢、改善肝功、减少肝脏脂质沉积保护肝脏组织，延缓疾病的发生发展。

基金资助:内蒙古自然科学基金面上项目(2019MS08178);

文章来源:薛君,张莹,董智慧,等.GLP-1类似物对糖尿病合并代谢相关脂肪性肝病自噬的影响[J].中国老年学杂志,2024,44(10):2477-2481.