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基于网络药理学的益气甘露方治疗糖尿病作用机制

2024-07-15 13 上传者：管理员

摘要：目的基于网络药理学方法筛选益气甘露方的有效成分、作用靶点及信号转导通路，探讨益气甘露方治疗糖尿病的潜在作用机制。方法筛选益气甘露方潜在活性成分及其对应靶点，应用Cytoscape 3.9.1软件对成分和靶点进行网络构建与分析。在GeneCards、TTD等数据库中筛选糖尿病相关靶点，取药物有效成分靶点与疾病靶点交集，在Metascape数据库中进行基因注释的GO分析和信号通路的KEGG富集分析。结果通过筛选得到益气甘露方活性成分(口服生物利用度(OB)≥30%且类药性(DL)≥0.18)157项，药物与疾病共同靶点247项，有效成分主要为槲皮素、山柰酚、7-O-甲基异木豆醇等，主要调节的通路为脂质与动脉粥样硬化信号通路，除此之外，还有PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路等。结论益气甘露方可能是通过调控脂质与动脉粥样硬化信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路等调节血糖代谢。

关键词：
作用靶点
多靶点
益气甘露方
糖尿病
网络药理学
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网络药理学以多组分、多靶点的方式，通过系统层次和生物网络角度，在分子层面进一步解释药物与疾病相关联的客观规律，因具有一定的整体性、系统性特点，网络药理学在中医药研究领域受到关注[1]。2型糖尿病是由于胰岛素分泌缺陷和(或)胰岛素抵抗引起的以长期高血糖并伴有多个靶器官损害为临床特点的慢性代谢性疾病，患者临床表现为血糖升高，伴有多饮、多食、多尿及体质量下降等症状。随着病情进展，易导致多种并发症，严重时甚至可危及生命。据IDF统计，目前在全球范围内，糖尿病患者近4亿，因此，糖尿病防治是当下需要解决的重大难题[2]。中医药注重个体化与整体的辨证施治理念，因此，探讨中医药对糖尿病防治具有重要意义。益气甘露方是由《医学衷中参西录》中的玉液汤为基础化裁，并根据名老中医经验总结而成，临床已证实是疗效确切、安全性较高的治疗糖尿病气阴两虚证的有效方剂。益气甘露方由多味中药材组成，成分复杂，药物作用靶点多样。本研究应用网络药理学探讨益气甘露方药物活性成分与糖尿病疾病的相互关系，阐明其治疗糖尿病的物质基础与作用通路。

1、资料与方法

1.1 数据库与软件

数据库包括中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)、GeneCards数据库、Uniprot数据库、 DAVID数据库、 OMIM数据库、Metascape数据库、String数据库；软件有Venny 2.1.0、Cytoscape 3.9.1。

1.2 成分与靶点筛选

在数据库中输入组成益气甘露方的中药材(主要为黄芪、西洋参、天花粉、山药、山茱萸、葛根、翻白草、乌梅、炙甘草),检索这些中药的化学成分。根据口服生物利用度(OB)≥30%且类药性(DL)≥0.18标准筛选潜在成分。通过TCMSP数据库中的Targets Information进一步查找益气甘露方中活性成分对应的靶点，并通过Uniprot数据库将其整理为基因格式。

1.3 查找糖尿病相关靶点

以糖尿病的英文名词“diabetes”及“diabetes mellitus”为关键词，在GeneCards和OMIM数据库中检索对应靶点，并将结果合集作为疾病相关靶点。

1.4 绘制益气甘露方靶点与糖尿病疾病靶点Venn图

将益气甘露方的相关靶点与糖尿病相关靶点全部输入Venny 2.1.0软件，绘制Venn图，取交集。

1.5 构建成分-靶点网络图

将益气甘露方的活性成分和相应靶点分别输入Cytoscape 3.9.1软件，构建成分-靶点网络，分析频次高的成分及靶点。

1.6 构建蛋白质-蛋白质相互作用网络(PPI)

取频次高的药物成分靶点基因和疾病基因交集，利用String数据库构建PPI网络；将物种设置为“Homo sapiens”,同时使用Cytoscape对网络进行可视化处理。

1.7 GO功能富集分析

将基因导入Metascape数据库，利用GO功能富集分析生物过程(BP)、分子功能(MF)和细胞组分(CC),并利用软件制作气泡图。

1.8 KEGG分析

将得到的交集靶点输入数据库，分析KEGG信号通路，入选条件为P≤0.05。

2、结果

2.1 益气甘露方活性成分筛选

通过数据库筛选并删除重复项，得到活性物质157个，其中，黄芪活性成分20个，西洋参活性成分11个，天花粉活性成分2个，山药活性成分16个，山茱萸活性成分20个，葛根活性成分4个，翻白草活性成分5个，乌梅活性成分8个，甘草活性成分为92个。

2.2 益气甘露方治疗糖尿病靶标预测

通过TCMSP 数据库筛选益气甘露方中有效成分所对应的靶点，去除重复，得到264个靶点。将所有靶点经过Uniprot数据库查询转化为基因符号格式，其中有2个靶点是微生物靶点。在GeneCards等数据库中，检索疾病相关靶点，得到17 705个靶点。将益气甘露方的化合物靶点与糖尿病相关的疾病靶点进行韦恩映射，获得247个共同基因。用Venny 2.1.0绘制韦恩图，见图1。

图1 药物有效成分靶点与疾病靶点的韦恩图

2.3 网络药理可视化

通过Cytoscape软件将益气甘露方活性成分对应的靶点导入Cytoscape中，计算相互作用节点数目，选取节点相互作用最多的前30个活性成分和对应的药物靶点，绘制益气甘露方活性成分-药物靶点相互作用网络图，见图2。用蓝色方形节点代表益气甘露方的有效化合物，用红色代表有效化合物对应的靶点。结果表明，益气甘露方活性成分相互作用最多的前30个靶点都是糖尿病共有靶点。核心靶点基因为PTGS2、ESR1、CALM2、HSP90AA1、NOS2、AR、PPARG、NCOA2、PIM1、PRSS1、GSK3B、CDK2、PTGS1、F10、ESR2、CCNA2、SCN5A、MAPK14、CHEK1、SERPIND1、DPP4、RXRA、ADRB2、PRKACA、TOP2B、ADRA1B、ACHE、CHRM1、NCOA1和F7。益气甘露方活性成分相互作用最多的前30种成分，见表1,发挥主要作用的成分包括槲皮素、山柰酚、7-O-甲基异木豆醇、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、β-谷甾醇、异鼠李素、柚皮素、美迪紫檀素、甘草醇酮等。

图2 益气甘露方活性成分-疾病靶点

表1 益气甘露方活性成分作用排前30的成分

2.4 PPI网络分析

利用STRING数据库构建筛选出来的30个核心靶点基因PPI网络图，其中有30个节点、105条边，平均节点度为7。Degree值排名靠前的10个靶点为ESR1、PPARG、PTGS2、HSP90AA1、GSK3B、AR、CDK2、ESR2、MAPK14、PRKACA,见图3。

2.5 GO分析

应用Metascape数据库对核心靶点进行GO分析，共获得343个GO条目，其中，生物过程(BP)涵盖276个条目，包括对激素反应、细胞对有机环化合物反应、细胞对氧化合物反应等，见图4;细胞组成(CC)涵盖28个条目，包括等离子膜架、转录调控因子复合物、中心体等，见图5;分子功能(Molecular Function, MF)共39个条目，包含蛋白质结构域特异性结合、聚合酶细胞特异性DNA结合转录因子结合、蛋白激酶结合等功能，见图6。

图3 交集靶点PPI网络

图4 益气甘露方治疗糖尿病GO生物过程分析

图5 益气甘露方治疗糖尿病GO细胞组成分析

图6 益气甘露方治疗糖尿病GO分子功能分析

2.6 KEGG通路分析

对益气甘露方靶点与糖尿病相关靶点的交集靶点进行KEGG通路分析，根据P≤0.05作为筛选条件，并使用显著性排名前20的通路进行绘制益气甘露方治疗糖尿病的核心靶点KEGG富集分析图，见图7。结果表明，益气甘露方治疗糖尿病涉及癌症信号通路、脂质与动脉粥样硬化信号通路、化学致癌-受体激活信号通路、化学致癌-活性氧信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、铂类药物耐受性信号通路、松弛素信号通路、FoxO信号通路、利什曼原虫病信号通路、神经退行性疾病通路、胰岛素信号通路、钙离子信号通路、cAMP信号通路等。其中，脂质与动脉粥样硬化信号通路、PI3K-Akt信号通路，MAPK信号通路和胰岛素信号通路与糖尿病密切相关。

图7 益气甘露方治疗糖尿病排名前20的KEGG通路分析

3、讨论

益气甘露方主要由黄芪、西洋参、天花粉、山药、山茱萸、葛根等组成，单味中药材成分均具有改善糖尿病的功能活性。有研究[3]显示，黄芪总黄酮能够改善糖尿病胆汁酸代谢障碍，黄芪甲苷Ⅳ具有预防糖尿病肾病的功效[4];西洋参丙二酰人参皂苷能够降低糖尿病小鼠的血糖和血脂[5];天花粉提取物或天花粉凝集素均可降低血糖水平[6,7];山药多糖对高脂饮食和链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠具有降低血糖作用[8];山茱萸乙醇提取物可以降低糖尿病大鼠血脂，并对肝脏有保护作用[9]。研究[10]表明，葛根素具有预防糖尿病、肾病的功效；翻白草水提物、总黄酮以及三萜类成分均可以降低血糖，改善糖尿病症状[11];甘草提取物及分离组分(如异甘草素、甘草甜素、甘草酸及其衍生物)具有降血糖活性[12,13]。

本研究发现，益气甘露方发挥主要作用的成分包括槲皮素、山柰酚、7-O-甲基异木豆醇、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、β-谷甾醇等。有研究[14]表明，槲皮素可以降低糖尿病大鼠的血糖水平，减少胰岛β细胞凋亡，对高糖刺激下的胰岛β细胞起到保护作用；槲皮素也可通过激活MAPK信号通路，降低大鼠血糖水平，改善胰岛素抵抗，与二甲双胍的作用相似[15]。山柰酚具有较强的抗氧化、抗炎等生物学活性，有研究[16]表明，其可以通过抑制MAPK、PI3K-AKT信号通路充分发挥抗炎作用；研究[17]发现，山柰酚可以降低糖尿病肾病炎症因子的表达水平，对肾脏细胞起保护作用。β-谷甾醇是植物甾醇中最具代表性的一种，可通过下调AKT、PI3K表达水平促进脂肪细胞吸收葡萄糖，具有较好的糖脂代谢调节作用[18]。

本研究显示，益气甘露方的核心靶点基因为PTGS2、ESR1、CALM2、HSP90AA1、NOS2、AR、PPARG、DPP4等，Cytoscape软件分析的核心靶点基因均为糖尿病相关基因，其中，DDP4和PPARG是糖尿病药物开发的重要靶点。通过益气甘露方靶点与糖尿病相关靶点交集靶点的KEGG通路分析发现，起重要作用且与糖尿病紧密相关的通路有脂质与动脉粥样硬化通路，除此之外，还有PI3K-Akt信号通路及MAPK信号通路。2型糖尿病患者通常会伴随严重的脂代谢异常[19],KEGG富集通路含有脂质与动脉粥样硬化通路，提示益气甘露颗粒可能会改善糖尿病伴随的脂质代谢异常。PI3K/Akt信号通路是胰岛素下游的重要信号传导途径，胰岛素通过与胰岛素受体α亚基结合，激活位于β亚基上的酪氨酸蛋白激酶、磷酸化胰岛素受体，进而激活PI3K,从而调节葡萄糖转化和糖原合成[20]。MAPK信号通路参与调控胰岛素抵抗，防止胰岛素受体底物与胰岛素受体结合[21]。本研究结果表明，益气甘露方的小分子活性成分可能通过多靶点调节以上信号通路，进而改善糖尿病症状。

综上所述，益气甘露方治疗糖尿病可能通过调节脂质与动脉粥样硬化信号通路、PI3K/Akt信号通路、MAPK信号通路等发挥治疗糖尿病的作用，但仍需通过进一步试验进行验证。益气甘露方治疗糖尿病的机制是多成分、多靶点、多通路的过程，本研究结果可为临床中应用中医药治疗糖尿病提供参考。

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