胃癌(GC)是常见恶性肿瘤，病死率较高，严重威胁人类健康[1]。化疗是治疗晚期GC的重要方法，而化疗耐药会影响治疗效果[2]。目前，奥沙利铂(L-OHP)是GC化疗常用药物，但L-OHP可使GC细胞产生耐药，影响患者预后[3]。研究发现，微小RNA(miRNA)在化疗增敏、化疗耐药中起重要作用，其可成为治疗靶点，有利于优化化疗方案[4,5]。miR-101-3p在GC患者中呈低表达，具有诊断GC的潜在价值[6],且过表达miR-101-3p可增加肝癌细胞对L-OHP的敏感性[7]。三磷酸腺苷结合盒转运体(ABC)C5在乳腺癌中呈高表达，与化疗敏感性呈负相关[8]。但miR-101-3p是否可通过靶向调控ABCC5逆转GC对L-OHP耐药尚未发现有关报道。本研究利用L-OHP诱导胃癌细胞SGC-7901构建耐L-OHP细胞株(SGC-7901/L-OHP),探究miR-101-3p靶向ABCC5逆转SGC-7901/L-OHP细胞的耐药机制。

1、材料与方法

1.1细胞、药物、试剂与仪器

人胃癌细胞SGC-7901(批号SC-30174)购自中国科学院上海细胞库。L-OHP(原料药，纯度≥99%,批号20210617,规格50 mg)购自浙江海正药业股份有限公司；miR-101-3p阴性对照(miR-101-3p NC)、miR-101-3p模拟物(miR-101-3p mimics)、空载体(pcDNA3.1)、ABCC5过表达载体(pcDNA3.1-ABCC5)、突变型ABCC5(ABCC5-MUT)载体、野生型ABCC5(ABCC5-WT)载体及所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成；RPMI1640培养基(批号AT1035-04)、胎牛血清(FBS,批号AT1297-01)、胰蛋白酶(批号AT1157-02)、LipofectamineTM2000转染试剂(批号AT1791-04)、实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒(批号AT1652-01)均购自北京沃卡威生物技术有限公司；RNA提取试剂盒(批号SJK5017)、反转录试剂盒(批号SJK6157)、噻唑蓝(MTT,批号SL3307)、二甲基亚砜(批号SJK14197)、聚偏氟乙烯膜(批号SJK20573)、基质胶(批号SJK26741)均购自美国Sigma公司；膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(AnnexinⅤ-FITC/PI)细胞凋亡检测试剂盒(批号BC7063)、双荧光素酶检测试剂盒(批号BC8117)均购自北京索莱宝生物科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(批号ab29152)、ABCC5(批号ab91723)、E-钙黏蛋白(cadherin,批号ab15472)、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2(批号ab16553)、N-cadherin,批号ab19427)、Bcl-2相关X蛋白(Bax,批号ab60178)抗体、羊抗鼠二抗(批号ab71422)均购自美国Abcam公司；CO2培养箱(型号SCO2W-2)购自美国Shellab公司；qRT-PCR仪(型号Q1600)、酶标仪(型号SY96S)、Transwell小室(型号7200)均购自北京智杰方远科技有限公司；光学显微镜(型号44110)、流式细胞仪(型号C6)、凝胶成像仪(型号JY-Clear)均购自北京科誉兴业科技发展有限公司。

1.2细胞培养及SGC-7901/L-OHP细胞株构建

将SGC-7901接种于RPMI1640培养基(含100 U/ml青霉素-链霉素双抗、10% FBS)中，于5%CO2、37℃培养箱中培养，0.25%胰蛋白酶消化、传代。取常规培养至对数生长期的SGC-7901,加胰蛋白酶消化，制备成单细胞悬液，接种于细胞培养瓶中。以含12.5μg/ml L-OHP(细胞抑制率为20%的浓度)的培养液培养，常规培养，多次传代，当细胞生长趋于稳定后，依次增加L-OHP浓度(25、50、100、200μg/ml),当SGC-7901细胞在200μg/ml L-OHP的培养液中可稳定生长、传代时，表明SGC-7901/L-OHP细胞株构建成功[9]。

1.3细胞转染与分组

将对数期SGC-7901/L-OHP细胞以1×105个/孔接种于6孔板，培养24 h后，随机分为正常对照组(NC组)、miR-101-3p NC组、miR-101-3p mimics组、miR-101-3p mimics+pcDNA3.1组、miR-101-3p mimics+pcDNA3.1-ABCC5组。依据LipofectamineTM2000转染试剂说明书分别将miR-101-3p NC、miR-101-3p mimics转染至miR-101-3p NC组、miR-101-3p mimics组SGC-7901/L-OHP中，将miR-101-3p mimics与pcDNA3.1、miR-101-3p mimics与pcDNA3.1-ABCC5分别共转染至miR-101-3p mimics+pcDNA3.1组、miR-101-3p mimics+pcDNA3.1- ABCC5组SGC-7901/L-OHP中，另外，NC组不做转染处理，用于对照研究。于含200μg/ml L-OHP的培养液中继续培养各组细胞24 h。各组均设6个平行样。

1.4 qRT-PCR检测细胞中miR-101-3p、ABCC5mRNA表达水平

收集培养的SGC-7901、SGC-7901/L-OHP及1.3中处理后的各组SGC-7901/L-OHP,利用RNA提取试剂盒抽提细胞总RNA,之后用反转录试剂盒合成cDNA。最后，按qRT-PCR法扩增miR-101-3p、ABCC5目的片段，其中反应体系及条件依照qRT-PCR试剂盒说明书进行。miR-101-3p、ABCC5分别以U6、GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-101-3p、ABCC5 mRNA相对表达量。北京索莱宝生物科技有限公司设计合成miR-101-3p、U6、ABCC5、GAPDH引物，引物序列(5′-3′)为miR-101-3p正向：GCCGCCACCATGGTGAGCAA-GG,反向：AATTGAAAAAAGTGATTTAATTT;U6正向：GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT,反向：CGC-TTCACGAATTTGCGTGTCAT;ABCC5正向：GGCTGTATTACGGAAAGAGGCAC,反向：TCTTCTGTGAACCACTGGTTTCC;GAPDH正向：CTATAAATTGAGCCCGCAGCC,反向：CGCCCAATACGACCAAATCC。

1.5 MTT法检测各组SGC-7901/L-OHP细胞活力

将对数期SGC-7901/L-OHP以1×104个/孔接种于96孔板，分组同1.3,每组设6个平行孔，培养48 h后，加MTT试剂，再培养4 h,弃上清，加二甲基亚砜，37℃平板摇床上震荡1 h。使用酶标仪测定各孔于490 nm处的OD值，细胞活力(存活率)=(各处理组OD值/NC组OD值)×100%。

1.6 Transwell小室法检测各组SGC-7901/L-OHP细胞迁移、侵袭能力

取按照1.3培养的各组细胞，用不含FBS的RPMI1640培养基，制成5×105个/ml的细胞悬液，取100μl接种于Transwell小室上室，加含200μg/ml L-OHP的培养液培养24 h,下室加600μl含20%FBS的RPMI1640培养基，37℃培养24 h,擦去小室内未迁移细胞，4%多聚甲醛固定下室膜26 min,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，0.1%结晶紫染色30～40 min。洗去多余染液、晾干，于光学显微镜下观察，并对穿过微孔膜的细胞进行计数。用预冷不含FBS的RPMI1640培养基稀释基质胶(培养基=1∶8比例),取20μl铺于Transwell小室的上室，于37℃恒温箱中放置过夜，等基质胶凝固。取按照1.3培养的各组细胞，用不含FBS的RPMI1640培养基，制成5×105个/ml的细胞悬液，其余操作与细胞迁移能力检测步骤相同。

1.7流式细胞仪检测各组SGC-7901/L-OHP细胞凋亡率

收集按照1.3培养的各组SGC-7901/L-OHP,3 900 r/min离心5 min,弃培养液，PBS洗涤两次，加400μl PBS重悬细胞，加5μl AnnexinⅤ-FITC染液，混匀，于避光条件下2～8℃孵育20 min,加10μl PI混匀，于避光环境下2～8℃孵育10 min后，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.8 Western印迹法检测细胞中ABCC5、E-cadherin、N-cadherin、Bax、Bcl-2蛋白表达

收集培养的SGC-7901、SGC-7901/L-OHP及按照1.3培养的各组SGC-7901/L-OHP,加放射免疫沉淀(RIPA)裂解液，冰上裂解20 min, 4℃、12 000 r/min离心8 min,去上清，按BCA法定量蛋白总浓度，之后进行电泳，以湿式转移法转至聚偏氟乙烯膜，用5%脱脂奶粉封闭1 h,加一抗(以1∶2 000稀释的ABCC5、E-cadherin、N-cadherin、Bax、Bcl-2、β-actin抗体),4℃孵育12 h,洗膜，加羊抗鼠二抗，孵育1 h,显色显影，以β-actin为内参，分析各目标蛋白相对表达水平。

1.9双荧光素酶报告基因实验验证miR-101-3p和ABCC5靶向关系

使用Target Scan Human7.2数据库预测miR-101-3p与ABCC5的结合位点。将构建好的ABCC5-WT、ABCC5-MUT载体分别与miR-101-3p NC、miR-101-3p mimics共转染至SGC-7901/L-OHP细胞，具体操作步骤按LipofectamineTM2000说明书进行，转染48 h后，利用双荧光素酶检测试剂盒测定各组荧光素酶活性。

1.10统计学分析

采用SPSS22.0软件进行独立样本t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2、结 果

2.1 SGC-7901、SGC-7901/L-OHP中miR-101-3p表达、ABCC5mRNA及蛋白表达水平比较

与SGC-7901相比，SGC-7901/L-OHP中miR-101-3p表达水平明显降低，ABCC5 mRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。见图1、表1。

2.2转染后各组SGC-7901/L-OHP细胞中miR-101-3p表达、ABCC5mRNA和蛋白表达水平比较

与NC组、miR-101-3p NC组相比，miR-101-3p mimics组、miR-101-3p mimics+pcDNA3.1组、miR-101-3p mimics+pcDNA3.1-ABCC5组细胞中miR-101-3p表达水平均明显升高，ABCC5 mRNA及蛋白表达水平明显降低(P<0.05);与miR-101-3p mimics组、miR-101-3p mimics+pcDNA3.1组相比，miR-101-3p mimics+pcDNA3.1-ABCC5组细胞中ABCC5 mRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。见图2、表2。

图1 SGC-7901、SGC-7901/L-OHP中ABCC5蛋白表达

与SGC-7901相比：1)P<0.05

表1 SGC-7901、SGC-7901/L-OHP中miR-101-3p及ABCC5 mRNA和蛋白表达水平比较

表2转染后各组SGC-7901/L-OHP中miR-101-3p表达、ABCC5 mRNA及蛋白表达水平比较

2.3转染后各组SGC-7901/L-OHP细胞活力、侵袭、迁移、凋亡比较

与NC组、miR-101-3p NC组相比，miR-101-3p mimics组、miR-101-3p mimics+pcDNA3.1组、miR-101-3p mimics+pcDNA3.1-ABCC5组细胞活力及侵袭、迁移细胞数明显降低，细胞凋亡率升高(P<0.05);与miR-101-3p mimics组、miR-101-3p mimics+pcDNA3.1组相比，miR-101-3p mimics+pcDNA3.1-ABCC5组细胞活力及侵袭、迁移细胞数明显升高，细胞凋亡率降低(P<0.05)。见图3、表3。

图3各组SGC-7901/L-OHP细胞侵袭、迁移(结晶紫染色，×200)及凋亡

表3转染后各组SGC-7901/L-OHP细胞活力、侵袭、迁移、凋亡情况比较

2.4转染后各组SGC-7901/L-OHP中E-cadherin、N-cadherin、Bax、Bcl-2蛋白表达水平比较

与NC组、miR-101-3p NC组相比，miR-101-3p mimics组、miR-101-3p mimics+pcDNA3.1组、miR-101-3p mimics+pcDNA3.1-ABCC5组细胞中E-cadherin、Bax蛋白表达水平明显升高，N-cadherin、Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P<0.05);与miR-101-3p mimics组、miR-101-3p mimics+pcDNA3.1组相比，miR-101-3p mimics+pcDNA3.1-ABCC5组细胞中E-cadherin、Bax蛋白表达水平明显降低，N-cadherin、Bcl-2蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。见图2、表4。

表4转染后各组SGC-7901/L-OHP细胞中E-cadherin、N-cadherin、Bax、Bcl-2蛋白表达水平

2.5 miR-101-3p与ABCC5靶向关系验证结果

经TargetScanHuman7.2数据库预测显示，miR-101-3p与ABCC5有结合位点。双荧光素酶报告基因实验检测结果显示，与miR-101-3p NC+ABCC5-WT组(1.04±0.11)比较，miR-101-3p mimics+ABCC5-WT组荧光素酶活性(0.57±0.07)明显降低(t=8.830,P<0.05);miR-101-3p NC+ABCC5-MUT组(1.01±0.10)与miR-101-3p mimics+ABCC5-MUT组荧光素酶活性(1.05±0.11)差异无统计学意义(t=0.659,P=0.525)。见图4。

图4 miR-101-3p与ABCC5 3'UTR区结合位点预测

3、讨 论

GC引起的死亡率在癌症中居于第二位，多数GC患者初次就诊时已处于晚期，错失手术机会，化疗成为治疗晚期GC的主要手段[10]。L-OHP等铂类化疗药是治疗GC常用药物，但GC患者在使用L-OHP过程中易产生耐药性，且耐药性可改变癌细胞自身，使其对L-OHP敏感性降低，降低患者治疗效果[11]。另外，GC对L-OHP耐药机制复杂，如癌细胞增强对药物外排作用、药物作用通路受抑制、靶点表达失调等[12]。因此，探究逆转GC细胞L-OHP耐药性相关机制对治疗GC有积极意义。本研究结果提示，SGC-7901/L-OHP细胞耐药机制可能与miR-101-3p、ABCC5关系密切。

miRNA是一类可调控基因表达的非编码RNA,在机体代谢、发育、细胞增殖、凋亡、迁移等过程中发挥重要作用[13]。miR-101-3p是miRNA成员之一，可靶向调控多种分子途径参与肿瘤病理发展[14]。研究发现，抑制miR-101-3p活性能够促进GC病变进程[15];miR-101-3p可影响膀胱癌细胞对顺铂的耐药性，为治疗膀胱癌提供新思路[16];此外，Sun等[7]发现，miR-101-3p通过抑制自噬进而逆转肝癌细胞对L-OHP的耐药性。本研究结果提示，过表达miR-101-3p可能抑制SGC-7901细胞活力、侵袭及迁移能力，并促其凋亡，进而逆转SGC-7901/L-OHP细胞耐药性。

ABCC5是一种体内广泛分布的转运蛋白，参与机体对内(外)源性物质及药物的吸收、排泄等过程，与肿瘤耐药密切相关[17]。研究发现，ABCC5在乳腺癌中过表达，发挥促癌作用，与化疗敏感性有关，其可作为评估预后的潜在指标[8];下调ABCC5表达可抑制结直肠癌细胞恶性发展，使其对5-氟尿嘧啶的敏感性增加[18]。本研究结果提示，过表达ABCC5可部分逆转过表达miR-101-3p对SGC-7901/L-OHP细胞活力、侵袭、迁移、凋亡的影响，进而影响SGC-7901/L-OHP细胞耐药性。

上皮-间充质转化(EMT)在恶性肿瘤细胞侵袭、迁移过程中发挥关键作用[19];另外，凋亡是细胞程序化死亡过程，在肿瘤生物学行为中有重要作用[20],因此抑制EMT、诱导胃癌细胞凋亡是抗胃癌的重要途径。研究发现，E-cadherin表达下调，N-cadherin表达上调是EMT的标志特征[12],而Bax是促凋亡基因，Bcl-2是抑制凋亡基因[21]。本研究结果提示，miR-101-3p可能通过下调ABCC5进而抑制EMT过程并调控凋亡相关因子表达，降低SGC-7901/L-OHP细胞侵袭、迁移能力，并同时促进凋亡过程，降低SGC-7901/L-OHP细胞耐药性。

本研究结果提示，miR-101-3p与ABCC5存在靶向关系。结合侵袭、迁移、凋亡等实验结果，推测miR-101-3p可靶向下调ABCC5,逆转SGC-7901/L-OHP细胞耐药性。

综上，在SGC-7901/L-OHP中，miR-101-3p表达下调，ABCC5表达上调，过表达miR-101-3p可靶向下调ABCC5,逆转SGC-7901/L-OHP细胞耐药性。本研究的局限性在于仅从体外探究了miR-101-3p对GC L-OHP的耐药作用机制，下一步将联合临床实验及动物模型实验进行深入探讨。

参考文献:

8张鹏,徐洪燕,孙勇.Sox2和ABCC5在乳腺癌中的表达及与化疗敏感性的关系[J].河北医药,2020;42(5):645-9.

9孙玉成,金恩鸿.二甲双胍对人胃癌SGC-7901/L-OHP细胞奥沙利铂耐药逆转作用的研究[J].中国临床研究,2018;31(4):499-504.

10 Fu L,Feng X,Jin Y,et al.Symptom clusters and quality of life in gastric cancer patients receiving chemotherapy[J].J Pain Symptom Manage,2022;63(2):230-43.

11齐雯丽,柯红,曾琼,等.miR-361-5p通过靶向CCND1逆转胃癌SGC-7901细胞奥沙利铂耐药性[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2021;28(4):346-52.

12刘耿,李永坤,刘洪锋.miR-106a-5p靶向ERK2逆转胃癌细胞MGC-803对顺铂化疗的耐药性[J].安徽医科大学学报,2020;55(5):722-8.

13赵铤,赵全丰,丁汉琳.舒芬太尼通过miR-365-3p/AKT1抑制胃癌细胞迁移､侵袭的研究[J].中国药师,2021;24(8):450-6.

基金资助:河北省医学科学研究课题计划项目(20191590);

文章来源:姚淑晖,张静,崔丽伟,等.miR-101-3p靶向ABCC5逆转胃癌奥沙利铂耐药的作用机制[J].中国老年学杂志,2024,44(16):3986-3991.