胃癌是一种常见的消化道肿瘤，其发病率和死亡率均位居各类肿瘤疾病的前列，且在近年呈上升趋势[1]，其给患者带来了巨大的身心痛苦和经济负担。胃癌发生前出现的胃黏膜病理组织学改变称为胃癌前病变，主要包括慢性萎缩性胃炎、胃黏膜异型增生、肠上皮化生等。其中慢性萎缩性胃炎是向胃癌发展的重要环节[2]，其主要病理学表现为胃黏膜表面慢性炎症伴胃腺细胞减少、丢失，胃黏膜腺体异型增生及肠上皮化生等。有研究[3]表明，慢性萎缩性胃炎向胃癌发展的过程中，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt）信号通路发挥了关键作用。

参佛胃康是陕西省名中医李守朝治疗慢性萎缩性胃炎的经验方。有研究[4]证实，该方治疗慢性萎缩性胃炎疗效确切，能改善胃黏膜慢性炎症，抑制胃癌前病变。本研究以PI3K/Akt信号通路为切入点，探讨参佛胃康治疗慢性萎缩性胃炎胃癌前病变的作用机制，为参佛胃康的临床应用提供依据。

1、材料与方法

1.1 实验动物

50只Wistar大鼠，雄性，4周龄，体质量80 g左右，由西安交通大学实验动物中心提供，饲养于陕西中医药大学实验中心；清洁级饲料喂养，环境温度：（22±4）℃，相对湿度：45%～75%；实验动物许可证号：SCXK（陕）2017-003；实验所有操作均遵循实验动物护理指南原则，实验通过动物伦理委员会审查（SUCMDL20200305022）。

1.2药物与试剂

参佛胃康组成：党参18 g、佛手8 g、砂仁6 g、陈皮12 g、白术15 g、黄连8 g、茯苓15 g等，中药饮片购买于陕西中医药大学附属医院中药房，饮片加水浸泡15 min，经煎煮、过滤等处理至含生药浓度为1.22 g/mL,4℃条件下保存。N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍[（1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine,MNNG),Tokyo Chemical Industry，批号：M0527，规格：5 g/瓶）]；盐酸雷尼替丁胶囊（江西汇仁药业，国药准字H36021340，规格：0.15 g/粒）；丽珠得乐（枸橼酸铋钾胶囊，丽珠制药厂，国药准字H10920098，规格：0.3 g/粒）；HE染色试剂盒（国药集团；批号：71014544);BCL-2抗体、PI3K、Akt、P-Akt（武汉三鹰生物技术有限公司，批号：26593-1-AP,60225-1-Ig,10176-2-AP,66444-1-Ig);P-PI3K(Abcam，批号：Ab182651）。

1.3仪器

CX21光学显微镜（日本奥林巴斯）；RM2016轮转式切片机（德国Leica公司）；电子天平（杰柏科技有限公司）；UVP凝胶成像系统（Thermo公司）；制胶板、半干转膜仪、电泳仪、电泳槽（美国Bio-Rad）。

1.4 实验方法

1.4.1 建立模型

将50只Wistar大鼠在标准分笼中饲养，采用随机数字表法，选择6只作为空白组，空白组接受清洁饲料饲养，其余大鼠进行造模。采用综合性MNNG复合造模方法，将MNNG混合在蒸馏水和浓度为50%的乙醇中，充分搅匀后配成母液，每周配制1次。将母液保存于4℃冰箱中，使用前将其稀释成浓度为170μg/mL的MNNG溶液，避光，每日自由饮用。同时，予造模大鼠含混合0.04%雷尼替丁的清洁饲料，按饱食两天、禁食1天方法干预，模拟饥饱失常状态，禁食日根据大鼠体质量用雷尼替丁与60℃的150 g/L热盐水按2.25 g/L混合后，按1 mL/100 g体积比例灌胃，每日通过刺激大鼠尾部以维持其活跃状态。以12周为界限，每两周从模型大鼠（包括中途死亡大鼠）中随机抽取2只麻醉处死，取其胃组织，若光镜下胃窦和胃体组织出现腺体紊乱、细胞核增大、核浆比例失调、细胞核异型性等特征，同时伴血液红细胞增多和炎性细胞浸润，符合慢性萎缩性胃炎病理诊断标准，判定造模成功。

1.4.2 分组及给药

在构建动物实验模型过程中，空白组大鼠全部存活，造模大鼠最终存活31只。第15周时将造模成功的31只大鼠随机分为胃癌前病变模型组（10只）、丽珠得乐组（10只）和参佛胃康组（11只）。给药前后测量并记录每只大鼠体质量。根据实验动物公式进行剂量换算，给药剂量：参佛胃康组为1.22 g/（kg·d），丽珠得乐组为0.18 g/（kg·d）；空白组和模型组灌胃生理盐水，各组每次灌胃2 mL，干预周期均为4周。第18周末处死大鼠。

1.5 观察指标

1.5.1 大鼠一般情况

观察各组大鼠毛色、精神、食欲、大便、活动及体质量变化情况。

1.5.2 大鼠胃黏膜形态与病理学观察

各组大鼠最后1次给药后，禁食24 h，待胃充分排空后处死，取出全胃观察其外部胃组织结构；沿胃大弯处切开胃组织，观察胃黏膜结构形态及色泽；胃窦部取两块约0.5×1.0 cm组织，使用10%福尔马林溶液固定，制作石蜡切片并进行HE染色，观察组织病理学变化。

1.5.3 PI3K、Akt、Bcl-2蛋白表达水平

采用Western blot法检测PI3K、Akt、Bcl-2蛋白的表达水平。利用RIRA裂解液提取各组大鼠胃黏膜组织蛋白后，采用BCA试剂盒进行定量，蛋白煮沸变性后，经SDS-PAGE分离蛋白并转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h,TBST洗膜3次；将PVDF膜与BCL-2抗体，PI3K、Akt、P-Akt一抗稀释液4℃孵育过夜，TBST洗膜3次与HRP标记山羊抗兔IgG、HRP标记山羊抗鼠IgG孵育2 h，再用TBST洗膜3次，加入显色液，采用美国UVP分析仪器，对显色胶片扫描，生成灰度值，目的蛋白的结果用灰度比值来表示。

1.6 统计学方法

采用SPSS 23.0分析数据，计量资料以表示，采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1 大鼠一般情况

空白组大鼠毛皮光滑且亮泽，行动灵活，好动，饮食正常，大便呈颗粒状，肛周干净整洁。模型组大鼠精神状态较差，行动迟缓，皮毛凌乱无光，饮食量减少，身体消瘦，粪便黏腻，肛周污秽。相较于空白组，参佛胃康组和丽珠得乐组大鼠精神状况稍欠佳，但整体表现优于模型组。实验过程中，空白组大鼠全部存活，模型组死亡2只，参佛胃康组和丽珠得乐组各死亡1只。

干预前空白组大鼠体质量高于其他3组（P<0.01）；模型组与参佛胃康组、丽珠得乐组大鼠体质量比较差异无统计学意义（P>0.05）。干预后模型组大鼠体质量变化幅度小于参佛胃康组和丽珠得乐组（P<0.05）；参佛胃康组大鼠体质量较丽珠得乐组增加（P<0.05）。干预过程中，各组大鼠体质量均呈现增长趋势，但空白组大鼠体质量增长幅度与其他3组相比差异明显，而模型组大鼠体质量增长幅度低于其他3组。见表1。

表1 各组大鼠干预前后体质量变化情况

注：与空白组比较，△表示P<0.01；与模型组比较，#表示P>0.05，##表示P<0.05；与丽珠得乐组比较，*表示P<0.05

2.2 胃黏膜形态与组织病理学变化

肉眼观察：空白组大鼠胃黏膜呈淡红色，富有弹性，表面光滑且有光泽，胃壁较厚且皱襞完整，黏液分泌较多；模型组大鼠胃黏膜呈淡白色或灰白色，胃壁较薄且弹性差，皱襞低平且部分黏膜可见多个出血点，黏液分泌较少；参佛胃康组与丽珠得乐组大鼠胃壁弹性较好，黏膜呈淡红色，有光泽，偶可见暗红色，有少量黏液分泌。显微镜下观察：空白组胃黏膜上皮完整且组织细胞形态均匀，腺体分布排列整齐，没有明显炎性细胞浸润迹象；模型组大鼠可见明显胃黏膜充血并出现水肿，腺体结构消失，腺体上皮细胞增生、形态多样且分布排列较乱，部分黏膜上皮脱落，血管增生明显，淋巴细胞聚集，黏膜下层可见弥漫性炎性细胞浸润，部分区域伴有肠上皮化生；丽珠得乐组大鼠胃黏膜腺体数量减少，排列欠规则，炎性细胞浸润程度较模型组轻，部分区域可见充血、水肿及淋巴细胞聚集；参佛胃康组大鼠胃黏膜上皮相对完整，细胞形态相对均匀，腺体数量较丽珠得乐组和模型组增多，分布排列相对整齐且规则，部分区域可见少量淋巴细胞聚集在黏膜浅层表面，局部存在炎性细胞浸润。见图1。

2.3 PI3K、Akt、Bcl-2蛋白表达水平

与空白组比较，模型组大鼠胃黏膜组织Bcl-2蛋白表达升高，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比例升高（P<0.01）；与模型组比较，参佛胃康组与丽珠得乐组大鼠胃黏膜组织Bcl-2蛋白的相对表达降低，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比例降低（P<0.01）；与丽珠得乐组比较，参佛胃康组大鼠胃黏膜组织Bcl-2蛋白的相对表达和p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比例降低（P<0.05）。见图2。

图1 各组大鼠胃黏膜组织病理学形态（HE，×100)

图2 各组大鼠胃黏膜组织PI3K、Akt、Bcl-2蛋白表达

3、讨论

3.1 PI3K/Akt信号通路与慢性萎缩性胃炎癌变

研究[5]表明，在癌变组织中，p-PI3K和p-Akt蛋白表达明显高于正常组织，且这两种蛋白表达的阳性率与患者病情进展程度呈正相关。此外，研究发现PI3K/Akt信号通路在胃黏膜细胞癌变过程中出现过度激活情况[6]。LIU等[7]研究证实，PI3K/Akt信号通路活化可促进胃癌细胞淋巴转移，说明PI3K/Akt信号通路与胃癌的发生、发展密切相关[8]，且对胃癌细胞增殖、侵袭和转移具有重要意义[9]。

3.2 Bcl-2蛋白与PI3K/Akt信号通路

有研究[10]发现，激活的PI3K/Akt信号通路可通过调节Bcl-2家族成员活性抑制细胞凋亡。Bcl-2家族成员分为抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白两类[11],Bcl-2蛋白属抗凋亡蛋白，其激活在细胞凋亡过程中发挥重要作用[12]。研究[13]证实，激活后的PI3K/Akt信号通路产生的生物因子会进一步激活Bcl-2，启动细胞抗凋亡机制，促使细胞异常增殖，导致细胞数量异常增多，最后形成异常的组织团块，而这些异常组织的形成通常与肿瘤的发生密切相关。

3.3 参佛胃康与慢性萎缩性胃炎

参佛胃康以六君子汤为基础加减而来，主要由党参、白术、茯苓、陈皮、半夏、砂仁、佛手等药物组成[14]。党参为君药，具有益气健脾之功；白术、茯苓、陈皮等取其健脾益气，燥湿化痰之功；佛手等理气止痛。诸药合用，君臣相配，以达健脾和胃，调和气血，标本兼治的目的[15]。现代药理研究[16]表明，参佛胃康具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、调节免疫等药理作用，可用于治疗胃溃疡、慢性胃炎等胃肠道疾病。

参佛胃康药物组成中含有多种具有抗肿瘤，提高免疫功能的中药。研究[17]发现，党参提取物党参多糖具有调节机体免疫功能、抗炎、抗病毒、抗肿瘤和抗氧化等作用。白术能够治疗多种胃肠道疾病，其作用机制包括调节胃肠道平衡、修复黏膜损伤、抗肿瘤、抗感染等[18]。研究[19]表明，白术内酯Ⅱ能够通过调节Bcl-2、Bax等蛋白表达，促进胃癌细胞AGS、HGC-27凋亡；茯苓的主要活性成分之一茯苓酸能够抑制肿瘤细胞迁移和侵袭[20]，茯苓皮中的三萜和多糖具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化等药理作用，能够促进肿瘤细胞凋亡[21]。陈皮中的多甲氧基黄酮可以抑制MGC803人胃癌-裸鼠移植瘤生长[22]；砂仁具有抗溃疡、抗炎、抗氧化、镇痛等药理作用[23]；佛手具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等药理作用[24]，且能够促进排便及胃肠道消化液的分泌[25]。研究[26]表明，黄连中具有槲皮素、β-谷甾醇等活性成分，槲皮素能抗炎、抗癌且具有生物代谢活性，β-谷甾醇有抑制肿瘤、修复组织作用。胡亚莉等[27]通过网络药理学研究发现，黄连在治疗慢性胃炎的相关方剂配伍中具有关键作用。综上所述，相关研究基本明确了参佛胃康治疗胃肠道疾病的作用机制以及其组成中不同中药的药理活性，这为临床应用提供一定依据，也为未来的临床治疗提供了更加明确的思路和选择[28]。

胃癌的发生与发展与PI3K、Akt、Bcl-2等蛋白异常表达密切相关。本研究结果表明，参佛胃康方能够改善胃癌前病变大鼠的一般情况及其胃黏膜病理状态，其作用机制可能与参佛胃康调控PI3K/Akt信号通路，抑制PI3K、Akt、Bcl-2蛋白表达，影响细胞凋亡有关。

本研究为参佛胃康治疗胃癌前病变提供了一定理论依据。目前，临床应用现代科学技术研究各类经方治疗胃癌前病变机制的相关实验越来越多[29]，这些研究成果证明了中医药在治疗癌前病变中的地位，也为中医药治疗胃癌前病变提供了新的思路和方法。

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基金资助:陕西省科技厅科研项目(2022JM-465);陕西省中医药管理局中医药科研课题(JCPT004);陕西中医药大学校级科研课题(2016QN07);咸阳市科技局科研课题(2018KT-42);

文章来源:李盟,赵迪,杜燕青,等.参佛胃康治疗慢性萎缩性胃炎胃癌前病变作用机制研究[J].西部中医药,2024,37(09):30-34.