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铅对线粒体毒性机制的研究进展

2024-06-17 24 上传者：管理员

摘要：铅对多种器官组织都具有毒性作用。尽管含铅汽油和油漆已被禁止使用，但环境中仍残留大量的铅，对公共卫生安全构成极大的威胁。因此，迫切需要明确铅毒性的作用机理。已有大量研究表明，线粒体是铅的敏感靶标。铅不仅会引起线粒体氧化应激和能量代谢障碍，还会引起线粒体功能障碍从而导致炎症、凋亡、自噬等紊乱。因此，线粒体功能障碍是铅毒性的重要机制。本文就铅对线粒体膜通透性、线粒体自噬、线粒体融合和分裂的影响的研究进展进行综述，以期为铅中毒的进一步机制研究和干预治疗提供参考依据。

关键词：
线粒体膜通透性
线粒体自噬
线粒体融合和分裂
铅
铅暴露
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铅（Pb）暴露是一个严峻的公共卫生安全问题。由于过去使用的含铅汽油、含铅油漆以及含铅水管等历史原因，公众面临着严峻的铅暴露风险。此外，血液中铅含量并没有明确的安全阈值，即使是极低水平的铅暴露也可能对人类健康造成危害[1]。因此，迫切需要深入阐明铅的毒性机理，以便为铅中毒的干预治疗提供参考依据。线粒体是一种特殊的细胞器，作为代谢中心和信号转导平台，参与一系列的细胞过程，如通过氧化磷酸化产生ATP、脂肪酸氧化、活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成和维持、Ca2+调节、先天免疫信号传导等[2]。线粒体是铅的敏感靶标，线粒体氧化应激是铅毒性的一个重要机制。Meta分析显示，铅可以在多种动物模型内导致细胞ROS水平升高[3]。线粒体氧化应激在铅毒性机制的研究中已经得到广泛关注，此外，线粒体膜通透性、线粒体自噬以及线粒体融合和分裂在维持线粒体正常功能中同样重要，因此，本文就铅对线粒体膜通透性、线粒体自噬以及线粒体融合和分裂的影响和机制研究进展进行综述，旨在为未来进一步研究铅中毒的机制以及对铅中毒进行干预治疗提供参考。

1、线粒体外膜通透性

Bax/Bak是线粒体膜上的凋亡相关蛋白，其通过调节线粒体外膜通透性(mitochondrial outer membrane permeabilization,MOMP)，将线粒体膜间隙中的凋亡相关蛋白释放到胞浆中调控细胞凋亡。MOMP受Bcl-2蛋白家族调控，具有抗凋亡作用的Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-W和Mcl-1等通过抑制促凋亡蛋白Bad、Bak、Bax、Bik、Bid等的活性和寡聚以抑制细胞凋亡。Bax蛋白是胞浆蛋白，只有一小部分定位于线粒体外膜(outer mito‐chondrial membrane,OMM)，并被抗凋亡蛋白Bcl-xl抑制激活。然而，Bax在结构上以线粒体为靶点不断向OMM转移，但Bcl-xl又不断地将OMM上的Bax逆转运到细胞胞浆中维持OMM上Bax平衡[4]。研究表明，铅可显著增加Bax的表达水平，同时显著降低Bcl-2表达水平，导致Bax的平衡被打破，大量Bax定位到OMM上与Bak相互作用形成同源二聚体，Bax二聚体和Bak二聚体进行同源寡聚或异源寡聚进而形成Bax/Bak复合物凋亡通道，引起细胞的凋亡[5]。Bcl-xl过表达可抑制Bax定位到OMM，从而减轻铅暴露引起的小鼠视杆细胞凋亡。铅还通过上调miR-16-5p，下调其靶基因磷脂酰肌醇-3-激酶调节亚单位1(phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1,PiK3R1)、胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF1R)和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)，随后通过肿瘤蛋白P53-Bcl-2/Bax-Cytc-caspase-9通路激活线粒体依赖的细胞凋亡途径[6]。共济失调-毛细血管扩张症突变蛋白(ataxia-telangiectasia mutated,ATM)可以通过磷酸化MDM2蛋白激活P53信号通路[7]。中国从事电子废物处理的成年男子血铅水平增加与ATM的mRNA水平增加存在关联。在人成纤维细胞中铅虽然对ATM的表达水平无影响，但会通过对ATM-Ser1981位点的磷酸化激活ATM的激酶活性[8]，表明铅有可能通过ATM-P53-Bcl-2/Bax通路改变MOMP，引起细胞凋亡。综上所述，蛋白激酶AKT和ATM通过激活P53引起MOMP的改变，表明通过蛋白激酶激活P53-Bax通路是铅的重要毒性机制之一。因此铅对其他蛋白激酶的影响可能是未来研究铅毒性机制的一个重要方向。

在正常生理条件下，Bak蛋白主要通过其结构性暴露的羧基末端(C-末端)跨膜结构域定位于线粒体内膜，并通过电压依赖性阴离子选择性通道蛋白2(voltage-dependent anion-selective channel protein 2,VDAC2)进一步锚定。VDAC2与Bak结合并抑制Bak的活性，并且阻碍Bak形成寡聚体[4]。在大鼠近端肾小管细胞中，铅暴露降低了VDAC2的翻译和转录水平[9]，表明铅可能通过抑制VDAC2的表达来释放Bak，从而引起MOMP的改变。然而，调控VDAC2在铅引起细胞损伤中的作用目前尚未见报道，铅对VDAC2与Bax结合的影响也尚未明确，这也是今后非常有潜力的研究方向。

2、线粒体通透性转换孔

线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeablity transition pore,mPTP)是存在于线粒体内外膜之间的一种蛋白质复合体，是一种非特异性通道，对于维持线粒体正常生理功能非常重要。mPTP的成分复杂，其主要组成成分有亲环素(cyclophilin D,CypD)、腺嘌呤核苷转运体蛋白(adeninenucleotidetranslocase,ANT)、VDAC[10,11]。当细胞受到ROS或钙超载等压力时，mPTP完全开放，细胞色素c(cytochrome c,Cyt-c)、凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)等释放到细胞浆中[12,13]，并通过caspase依赖或非依赖的机制诱导细胞凋亡。研究表明，铅刺激SH-SY5Y细胞mPTP开放，诱导caspase依赖性细胞凋亡，CypD抑制剂CSA以及CypD敲除可抑制mPTP的开放以及细胞凋亡过程[14]。mPTP的其他2个组分VDAC抑制剂DIDS、ANT抑制剂BA同样可以缓解铅暴露引起的细胞凋亡[9]。这表明mPTP是铅毒性的重要机制。

研究表明，在较低浓度下铅暴露对嗅觉细胞DBC1.2凋亡相关蛋白的表达水平没有影响，而参与调控细胞程序性死亡的受体相互作用蛋白激酶3(receptor interacting protein kinase 3,RIPK3)和混合谱系激酶结构域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)的转录水平显著增加[15]。在心脏微血管内皮细胞中，缺血再灌注会激活RIPK3，从而上调磷酸甘油酸变位酶5(phosphoglycerate mutase 5,PGAM5）的表达，进而增加CypD Ser31位点的磷酸化水平，最终导致mPTP开放并激活细胞程序性死亡[16]。此外，CypD还通过介导AIF的核转位引起细胞程序性死亡[17]。综上所述，铅暴露会影响RIPK3的表达水平，但是RIPK3-PGAM5-CypD通路介导的细胞程序性死亡是否是铅毒性的潜在机制还需进一步深入探究。

线粒体钙单向转运体(mitochondrial calcium uniporter,MCU)是控制线粒体Ca2+摄取的最主要离子通道，通过调节Ca2+内流影响mPTP的开放。在人肝癌HepG2细胞上钌红通过抑制MCU的开放从而抑制线粒体对铅的摄取[18]。推测抑制MCU可减少铅对线粒体的影响，然而在SH-SY5Y细胞中，铅暴露以剂量依赖的方式降低了MCU的表达且抑制了线粒体Ca2+内流，使用MCU激活剂精胺及MCU过表达逆转了铅引起的氧化应激，而敲除MCU加重了铅毒性作用[19]，与前文抑制SH-SY5Y细胞mPTP开放缓解铅的毒性相矛盾，这表明MCU在铅毒性中的机制复杂，需要进一步深入研究。

VDAC的主要成分是VDAC1，铅暴露降低了VDAC1的转录水平[20]，同时VDAC1可以寡聚形成通道介导线粒体DNA的释放[21]，近年来的研究验证了线粒体DNA逃逸释放在先天免疫系统激活和炎症中的作用。因此，铅暴露对VDAC1寡聚的影响以及线粒体DNA逃逸释放是未来值得研究的方向。

3、心磷脂

心磷脂(cardiolipin,CL)是线粒体内膜的一个特征性磷脂，铅暴露通过磷脂加扰酶3(phospholipid scram‐blase 3,Plscr3)过表达，将线粒体内膜上约20%的CL转移至外膜，同时引起t-Bid和caspase-3转移到线粒体外膜来介导细胞凋亡[22]，敲除Plscr3可抑制CL向外膜转移，缓解Gasdermin D引起的线粒体损伤和细胞焦亡[23]。蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)是Plscr3的上游调控因子，PKC-δ促进Plscr3-Thr21位点磷酸化增加Plscr3磷脂酶转运活性，过表达线粒体靶向的PKC显著增加了细胞凋亡[24]，而突变PKC缓解了铅引起的秀丽线虫的神经毒性[25]。以上结果表明，铅可能通过PKC-Plscr3-CL途径引起线粒体IMS中的凋亡因子释放到胞浆中从而激活细胞凋亡。

4、线粒体自噬

线粒体自噬是一种重要的线粒体质量控制机制，其通过清除受损线粒体参与调控代谢重编程、线粒体融合和分裂、细胞周期调控以及细胞凋亡等多种细胞生理过程。研究表明，铅显著增加SH-SY5Y细胞自噬标志蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg5和Beclin-1的表达水平[26]。在铅处理的HEK293细胞中，LC3Ⅱ聚集在线粒体周围且线粒体与溶酶体共定位增加，线粒体自噬的主要通路PINK1/Parkin的磷酸化水平增加，提示PINK1/Parkin通路被激活[27]。表明铅激活了线粒体自噬。ATM是一种Ser/Thr激酶，铅能够增加ATM在Ser1981位点的磷酸化，从而激活ATM。同时，p-ATMSer1981与PINK1/Parkin有共定位，进一步的免疫共沉淀实验提示p-ATM Ser1981和PINK1可能存在相互作用，ATM敲除抑制了铅引起的线粒体自噬，但对PINK1/Parkin的磷酸化水平没有影响[27]。作为PINK1/Parkin通路的下游因子，DJ-1敲除在不影响PINK1/Parkin激活水平的情况下可以抑制线粒体自噬[28]，因此，ATM可能通过直接影响DJ-1等PINK1/Parkin通路的下游因子来调控线粒体自噬。线粒体融合和分裂失衡是线粒体自噬的上游事件，研究发现在铅处理的成纤维细胞中ATM与线粒体动力相关蛋白p-Drp1的共定位增加，敲除ATM可加重铅引起的线粒体分裂[8]，提示ATM也可能通过调控线粒体融合和分裂调控线粒体自噬。

丝氨酸/苏氨酸激酶AMP-活化蛋白激酶(serine/threonine kinase AMP-activated protein kinase,AMPK)在线粒体氧化磷酸化和氧化应激中具有重要作用，同时激活的AMPK可介导受损线粒体清除，AMPK的β亚基的肉豆蔻酰化导致AMPK定位于线粒体。在线粒体自噬过程中AMPK通过磷酸化ULK1 Ser555位点促进ULK1向线粒体转位，突变ULK1的磷酸化位点导致细胞中受损的线粒体数量显著增加[29]。研究发现ULK1会直接磷酸化Parkin而激活线粒体自噬，表明AMPK-ULK1轴在线粒体自噬中发挥重要作用[30]。研究表明，抑制AMPK的激活通过降低氧化磷酸化水平和引起氧化应激是铅毒性的重要机制[31,32]。然而，铅是否通过AMPK-ULK1轴来影响线粒体自噬仍需进一步探究。

5、线粒体融合和分裂

线粒体在细胞内动态运动以保证发挥正常功能，线粒体的动态运动也是其自我修复的先决条件，线粒体融合和分裂动态变化可保障线粒体在细胞内的运动和分布调节[33]。铅处理引起原代大鼠海马神经元细胞线粒体过度分裂，线粒体融合蛋白（mitochondrial fusion protein,MFN）、MFN1和MFN2的表达水平显著降低，同时铅还通过促进PTEN-诱导激酶(PTEN-inducedputativekinase1,PINK1)与MFN2的结合使MFN2泛素化增加，进一步降低MFN2表达水平，而PINK1敲除逆转了铅引起的线粒体过度分裂并且改善了细胞损伤[34]。在SH-SY5Y细胞中，线粒体分裂抑制剂Mdivi-1逆转了铅引起的细胞损伤，改善了ATP生成及Na+-K+-ATPase的活性[32]。上述研究结果表明诱导线粒体过度分裂是铅的毒性机制之一。铅处理对人成纤维细胞ATM的表达水平没有影响，但p-ATM Ser1981水平增加，且p-ATM Ser1981与Drp1和p-Drp1Ser616的共定位明显增加，而与MFN2和OPA1的共定位显著减少，因此ATM可能是铅诱导线粒体过度分裂的重要调节因子[8]。Drp1通过Ser616处的磷酸化定位到线粒体上，从而激活线粒体分裂。铅暴露以ROS依赖的方式增加p-Drp1 Ser616水平和线粒体分裂，AMPK激活剂二甲双胍通过激活AMPK/Nrf2通路降低ROS水平，从而逆转铅诱导的线粒体过度分裂[32]。线粒体分裂因子(mitochondrial fission factor,MFF)位于线粒体外膜上，是Drp1的主要受体，AMPK通过磷酸化MFF的Ser155和Ser172位点促进Drp1转位到线粒体上来调节线粒体分裂[29]，这表明铅可能通过AMPK-MFF-Drp1通路调控线粒体融合和分裂。

6、总结与展望

铅对线粒体氧化磷酸化的影响已有明确证据，线粒体作为信号转导平台，线粒体膜通透性变化可能导致线粒体内和线粒体膜间隙中的信号分子释放到胞浆中，被胞浆中的受体识别并激活下游通路而调节细胞状态。铅对线粒体膜通透性的影响机制已经取得了许多进展，ATM和AMPK不仅参与铅对线粒体氧化磷酸化和氧化应激的影响，还在调节MOMP、线粒体自噬以及线粒体融合和分裂中发挥作用，因此ATM和AMPK可能是有效干预铅毒性的潜在靶点。然而，线粒体膜的成分非常复杂，其成分和功能尚未完全明确，因此，铅对线粒体膜通透性的影响在铅毒性中的作用需要未来进一步深入研究。mtDNA作为一个新兴的信号分子，是近年的研究热点，其可以通过线粒体膜通透性改变释放到胞浆中，从而激活NLRP3炎症通路和cGAS-STING先天免疫通路[35]。虽然铅对线粒体膜通透性的影响已经明确，然而关于铅对mtDNA逃逸释放的影响尚未有报道，因此mtDNA的逃逸释放及其下游激活的通路可能是未来非常有潜力的铅毒性机制研究方向。

文章来源:田嘉成,许商成.铅对线粒体毒性机制的研究进展[J].局解手术学杂志,2024,33(06):541-545.