反式脂肪酸(trans fatty acid, TFA)指结构中含有反式非共轭双键的不饱和脂肪酸的总称。TFA被大量应用于人造奶油、油炸食物及其他包装食品，具有耐高温、增加酥脆感及延长食品保存期等特性[1]。TFA对人体产生的不利作用已引起了各国的广泛关注。研究显示TFA可影响人的认知功能，反式化学结构与顺式结构极其相似，大脑不能完全区分，在形成新的神经细胞时会利用或部分利用TFA,对认知产生影响[2]。妊娠期和新生儿期的饮食对大脑健康有重要影响，可能会对大脑产生持久的影响，尤其在孕期，子代大脑发育所需的脂肪酸完全来源于母代，母代脂肪组成失衡如含较多量的TFA,会通过血脑屏障损害子代脑部发育，对新生儿大脑发育及认知功能产生影响[3]。近年来发现一些天然食物中含有某些可改善认知功能的营养物质，如某些多酚类提取物可以通过降低氧化应激和炎症水平来预防和逆转与年龄相关的认知障碍[4]。

多酚类物质在大脑健康及抗衰老作用方面的应用是一个新兴领域，亚麻木酚素(secoisolariciresinol diglucoside, SDG)就是其中的一种。SDG分子中带有开环异落叶松酚二葡萄糖苷结构，主要存在于亚麻籽中，在各种神经系统疾病模型中被证实有抗炎和抗氧化作用[5]。SDG在机体内的代谢产物较SDG本身更易于穿过血脑屏障，利于其对脑部发挥保护作用，且在体外对一氧化氮和促炎细胞因子也有很好的抑制作用[6]。鉴于此，本研究以C57BL/6小鼠为研究对象，使用反式脂肪酸和不同剂量亚麻木酚素，对妊娠期小鼠进行干预，探讨TFA致子代脑部氧化应激损伤及亚麻木酚素的保护作用，并探讨Nrf2/Keap1通路在其中的作用。

1、材料与方法

1.1试剂及仪器

TFA(纯度>97%),购于上海TNI梯希爱公司；SDG (纯度为98%),由成都植标化纯生物技术有限公司提供，批号为PS-2001109;4%多聚甲醛(Biosharp公司);丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)试剂盒，反转录试剂盒，β-淀粉样蛋白(amyloid-β,Aβ)1-40及Aβ1-42蛋白抗体试剂盒(碧云天公司);PCR检测试剂盒(GenStar公司);核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)、血红素加氧酶-1(hemeoxygenase-l, HO-1)、醌氧化还原酶1(quinone oxidoreductase 1,NQO1)、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1)和β-肌动蛋白抗体(武汉三鹰公司)。

倒置显微镜(日本Olympus公司);酶标仪(伯腾公司);realtime PCR仪(美国Thermo Fisher Scientific公司);WB凝胶成像系统(上海伯乐生命医学产品有限公司)。

1.2实验动物及分组处理

48只8～9周龄SPF级C57BL/6小鼠，雌30只、雄18只，体重(21±2)g,购自河南省斯克贝斯生物，合格证号SCXK(豫)2020-0005。饲养于蚌埠医科大学动物实验中心，使用许可证号SYXK(皖)2023-009,温度(24±2)℃,相对湿度(55±5)%,通风良好，提供自然昼夜光，小鼠自由摄食饮水。本项目经蚌埠医科大学动物伦理委员会批准(No.伦动科批字[2021]第214号)。

按随机数字表法将30只雌性C57BL/6小鼠随机分为5组：对照组，TFA暴露组，TFA暴露+SDG低、中、高剂量干预组。适应性喂养后，按雄鼠与雌鼠1∶2的比例合笼隔夜受孕，次日早晨出现阴栓判定为受孕并纳入实验阶段。TFA组孕鼠每日灌胃TFA 60 mg/kg[7-9];SDG组除TFA灌胃外，同时饲料中分别添加10、20和30 mg/kg SDG,按母鼠体重(20±2)g,每日自由摄食饲料摄入量为(10±2)g,换算为SDG摄入量5、10及15 mg/kg·d,该剂量参考欧洲、美国居民反式脂肪酸平均摄入量分别为2.7和5.8 g/d,按标准体重60 kg折合为45和96.6 mg/kg·d得出[1];对照组每日用生理盐水灌胃。对母鼠的处理贯穿于妊娠期，而对子鼠不采用TFA及SDG处理，子鼠出生后用普通饲料继续喂养母鼠至子鼠断奶(21 d),处理子鼠。

1.3计算脑重系数

实验期间观察各组母鼠神态、摄食、活动及体重情况；观察子鼠生长发育情况。实验结束，称取子鼠体重3次取均值(精确度0.1 g);麻醉子鼠脱颈致死，称其脑重(精确度0.01 g),计算脑组织质量占体重的百分比。

1.4氧化应激指标检测

取各组子鼠部分脑组织匀浆，按照试剂盒说明书检测SOD、GSH-Px及MDA水平。

1.5炎性因子及Aβ蛋白水平检测

按试剂盒说明，ELISA酶联免疫吸附实验检测脑组织匀浆液中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)、干扰素-γ(interferon gamma, IFN-γ)、Aβ1-40及Aβ1-42蛋白水平。

1.6实时定量PCR检测Nrf2、Keap1、NQO1及HO-1 mRNA表达

Trizol法提取子鼠脑组织总RNA,按要求配置20μL Real-time -PCR反应液，反转录成cDNA,扩增条件为95℃2 min, 95℃15 s, 62℃1 min,循环40次。Gapdh为内参，引物序列由上海生工和北京梓煕生物公司合成(表1)。

表1引物序列

1.7蛋白质印迹法检测Nrf2、Keap1、NQO1及HO-1蛋白表达

裂解液RIPA裂解细胞，提取脑组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。配制10%的凝胶系统进行电泳，转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭处理后，分别加入一抗β-actin(1∶20000)、Nrf2(1∶3000)、Keap1(1∶4000)、HO-1(1∶4000)、NQO1(1∶20000),4℃孵育过夜。TBST洗涤3次，加入二抗(1∶4000山羊抗兔IgG),室温孵育2 h;再次洗涤，ECL发光剂显色。选择β-actin作为内参，Image J计算各条带灰度值。

1.8统计学分析

使用SPSS 25.0软件，结果以

表示。符合正态分布及方差齐性要求，采用One-way ANOVA,组间均数采用LSD检验进行比较；否则采用Duunnett’s检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1子鼠一般情况及脑重系数

实验期间，各组母鼠毛发光泽顺滑，精神状态无异常，摄食量、饮水量正常；子鼠雌、雄数量均衡，外观及精神状况无异常。由表2可知，各组之间体重、脑重及脑重系数差异均无统计学意义。

表2亚麻木酚素(SDG)和反式脂肪酸(TFA)对妊娠母鼠子代脑重系数的影响

2.2氧化应激指标

由表3可知，与对照组相比，TFA暴露组子代脑部SOD及GSH-Px活性降低、MDA含量升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。与TFA暴露组相比，SDG各干预组中SOD(中、高剂量组)及GSH-Px(低、中、高剂量组)活性升高，MDA含量(中、高剂量组)降低(P<0.05)。

表3亚麻木酚素(SDG)和反式脂肪酸(TFA)对妊娠母鼠子代脑组织氧化应激指标的影响

2.3炎性因子及Aβ蛋白水平

由表4可知，TFA暴露组子代脑部IFN-γ、TNF-α含量及Aβ1-42蛋白水平高于对照组(P<0.05)。SDG干预后，与TFA暴露组相比，中、高剂量组IFN-γ含量降低(P<0.05);各干预组TNF-α含量均低于TFA暴露组，且随剂量的增加，TNF-α含量逐渐减少(P<0.05);中、高剂量组Aβ1-42蛋白水平均低于TFA组，同时低于低剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

注：IFN-γ:干扰素-γ;TNF-α:肿瘤坏死因子-α;Aβ:淀粉样蛋白-β;(1)与对照组相比，P<0.05;(2)与TFA暴露组相比，P<0.05;(3)与SDG低剂量组相比，P<0.05;(4)与SDG中剂量组相比，P<0.05

表4亚麻木酚素(SDG)和反式脂肪酸(TFA)对妊娠母鼠子代脑组织炎性因子及Aβ蛋白水平的影响

2.4 Nrf2、Keap1、NQO1、HO-1 mRNA及蛋白表达

由表5可知，与对照组比较，TFA暴露组子鼠脑部Nrf2及HO-1 mRNA表达均下调，而Keap1 mRNA表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)。与TFA暴露组相比较，SDG中、高剂量组Nrf2及HO-1 mRNA表达均上调，而Keap1 mRNA表达下调，其差异有统计学意义(P<0.05)。各组NQO1 mRNA无明显变化(P>0.05)。

注：Nrf2:核因子E2相关因子2;Keap1:Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1;NQO1:醌氧化还原酶1;HO-1:血红素加氧酶-1;(1)与对照组相比，P<0.05;(2)与TFA暴露组相比，P<0.05;(3)与SDG低剂量组相比P<0.05;(4)与SDG中剂量组相比，P<0.05

表5亚麻木酚素(SDG)和反式脂肪酸(TFA)对妊娠母鼠子代脑组织Nrf2、Keap1、NQO1、HO-1 mRNA及蛋白表达的影响

由表5及图1可知，与对照组相比，TFA暴露组子鼠脑中Nrf2、NQO1及HO-1蛋白表达均下调，而Keap1蛋白表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)。与TFA组相比，SDG干预后各剂量组Nrf2、NQO1及HO-1蛋白表达均上调(Nrf2指标表现为中、高剂量组上调),而Keap1蛋白表达下调，且随剂量增加，下调更明显(P<0.05)。

3、讨论

本研究显示，小鼠妊娠期60 mg/kg TFA灌胃暴露可降低子代脑部SOD、GSH-Px活性，升高MDA含量、IFN-γ、TNF-α及Aβ1-42蛋白水平，证实TFA对子代脑部造成某种程度氧化损伤及炎症反应，同时饲料摄入5～15 mg/kg的SDG干预对子代脑部氧化应激可产生一定程度的修复作用。氧化应激是诱导阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)等神经退行性疾病发生的关键病因之一，是AD的早期事件。氧化应激可激活剪切淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)形成Aβ的β-分泌酶和γ-分泌酶，并抑制α-分泌酶， 促进Aβ产生[10]。Aβ的组成成分主要为Aβ1-40和Aβ1-42,研究证实神经纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFT)及老年斑(senile plaque, SP)为AD的主要特征性病理改变，Aβ1-42为SP的生物学标志物。Aβ1-42敏感性较高，检测其在脑脊液中的水平有利于早期判断AD病理学改变[11]。本研究结果证实TFA及SDG对Aβ40水平影响不明显，但对Aβ42水平有影响，TFA会导致子代小鼠脑部Aβ42水平升高，而SDG对此有抑制作用。本研究结果显示，TFA暴露使子代小鼠脑中产生过量的TNF-α与IFN-γ,但SDG干预的小鼠脑组织中两者含量均降低，从而减少相关神经毒性物质的产生，减轻免疫炎症反应，起到保护作用。

图1亚麻木酚素(SDG)和反式脂肪酸(TFA)对妊娠母鼠子代脑组织Nrf2、Keap1、NQO1、HO-1蛋白表达的影响

Nrf2:核因子E2相关因子2;Keap1:Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1;NQO1:醌氧化还原酶1;HO-1:血红素加氧酶-1

神经炎症与氧化应激在TFA引起的神经退行性疾病中起重要作用，在此过程中，Aβ与二者之间存在着密切、复杂的联系。研究显示，TFA可使细胞中ROS过量产生，促进Aβ产生；同时Aβ又反作用于线粒体促进ROS产生， 加剧恶性循环[12]。ROS可通过激活关键的信号途径增加TNF-α等炎性因子产生，引发炎症反应，炎性因子也可以破坏机体抗氧化系统的作用，加剧氧化应激；小鼠炎性因子(TNF-α、IL-1β、IFN-γ和TGF-β等)可通过JNK依赖的MAPK途径刺激β-分泌酶和γ-分泌酶，从而裂解APP并启动Aβ形成，导致Aβ1-42的表达增加[13]。因此，氧化应激可能起到关键的桥梁作用，通过清除ROS来抑制相关酶的表达可作为抵抗神经炎症及相关疾病的一个靶点。SDG的干预可不同程度抑制TFA暴露所致的子代脑部氧化应激损伤、炎性状态及Aβ42水平的升高，说明SDG是一种神经保护剂，与BOWERS等[14]的研究结果一致。

Nrf2/Keap1信号通路在抵御由炎症反应和氧化应激诱发的多种疾病发生过程中扮演重要角色，是体内调控氧化应激的重要通路之一[15]。Nrf2是细胞抗氧化应激的关键因子，Nrf2通常与抗氧化反应序列元件(antioxidant response element, ARE)相互作用编码抗氧化蛋白。生理状态下，Nrf2与胞浆蛋白伴侣蛋白Keap1在胞浆内结合，其活性处于抑制状态，调节蛋白Keap1对Nrf2具有抑制作用；氧化应激发生时，Nrf2与Keap1解偶联并转移至胞核内与ARE结合，Nrf2处于被激活状态，启动下游抗氧化基因及Ⅱ相解毒酶基因如HO-1、NQO1等转录， 提高抗氧化酶的表达水平，清除自由基，减轻机体组织氧化应激损伤[16]。

本研究结果证实母鼠妊娠期60 mg/kg TFA灌胃暴露可抑制子代脑部Nrf2/Keap1信号通路相关蛋白表达，对子代脑部造成某种程度氧化应激损伤及炎症反应，促进Aβ产生。同时5～15 mg/kg的SDG干预可提高子鼠脑部Nrf2、HO-1 mRNA及Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达水平，抑制Keap1 mRNA及蛋白表达水平，提高SOD及GSH- Px活性，降低MDA、IFN-γ、TNF-α及Aβ1-42水平。提示SDG可能通过对Nrf2/Keap1信号通路的调节，上调Nrf2 mRNA及蛋白表达，下调Keap1 mRNA及蛋白表达，启动下游NQO1、HO1等基因和蛋白表达，缓解TFA诱导的ROS水平的增加从而起到抗氧化作用。但在探讨上下游分子机制时由于未采用动物敲除基因/抑制剂对Nrf2信号进行干预措施，使本研究存在一定的局限性。且本研究显示，各组NQO1 mRNA表达未见明显变化，与NQO1蛋白的变化存在不一致的现象，需要进一步探讨。

参考文献:

[9]陈美庆,朱润泽,吴天宇,等.亚麻木酚素对母鼠反式脂肪酸暴露致子代肾氧化损伤的保护作用[J].中南大学学报(医学版),2023,48(7):967-978.

[15]郑冬晓,陈琳琳,韦其慧,等.褐藻素通过调控Nrf2/Keap1通路缓解糖尿病大鼠心肌肥大[J].南方医科大学学报,2022,42(5):752-759.

基金资助:蚌埠医学院自然科学重点项目(No.2020byzd041);安徽省高等学校自然科学重点研究项目(No.2022AH051435);

文章来源:张畔畔,陈美庆,朱润泽,等.亚麻木酚素抑制反式脂肪酸致小鼠子代脑部氧化应激和炎症反应的作用[J].卫生研究,2024,53(05):771-777.