Epstein-Barr病毒是一种十分常见的γ-1型疱疹病毒,感染率多达90%[1]。EBV具有强大的诱导淋巴细胞恶性转化的能力,其致癌作用首次在Burkitt淋巴瘤细胞系中得以明确,随后在其他淋巴瘤中也相继报道,包括弥漫大B细胞淋巴瘤及其他淋巴瘤亚型[2,3]。2016年世界卫生组织(WHO)将EBV相关DLBCL被划分为DLBCL的新亚型(EBV+DLBCL,NOS)[4]。EBV+DLBCL,NOS的中国患者比例高于西方国家,大多伴随不良预后结局。病理样本中EBER检测是EBV+DLCBL诊断的金标准。此外,EBVDNA拷贝数、EBV血清抗体谱和分子生物学特征可作为EBV+DLBCL重要辅助检测手段,在动态监测疗效及评估预后有特殊应用价值。目前EBV+DLBCL,NOS的治疗手段以化疗为主,大多数患者临床疗效仍不理想。因此,深入探讨EBV+DLBCL的疾病特征,揭示疾病发生机制和影响临床疗效的因素,是目前EBV+DLBCL临床治疗中亟待解决的问题。本文将重点阐述EBV+DLBCL的诊断、监测、治疗新进展,以期多方位把握EBV+DLBCL疾病特征,为提升疾病临床诊疗疗效,提升患者预后和推动精准医疗的发展做出努力。

1、EBV阳性DLBCL的诊断

1.1EBV阳性DLBCL的病理诊断

EBV+DLBCL的诊断要点在于组织病理学检测。EBV潜伏感染的肿瘤细胞可稳定高表达病毒转录本EBER,因此EBER原位杂交针是鉴定EBV感染的金标准[5]。依据EBER诊断标准,目前国内外研究发现EBV+DLBCL具有两个流行病学特征:其一为具有地域性倾向特征。在亚洲及南美洲的大样本人群研究证实EBER检出率高(EBER检出率6.9%～15.0%),且普遍存在不良预后。相反在欧美国家中,EBV+DLBCL的发生较为少见(EBER检出率2%～4%)且无显著不良临床特征[6]。其二为发病愈发趋向年轻化。Hong等证实不论老年患者或是年轻患者,EBER阳性均能作为一个显著不良预后的指标[7,8]。因此,在2016年WHO将老年EBV阳性DLBCL(EBV+DLBCL-E)更新为EBV阳性DLBCL,非特指型(EBV+DLBCL,NOS)[4]。

除了EBER外,一些肿瘤标记物也可作为辅助病理诊断方法。据报道,通过病理检查发现绝大多数EBV+DLBCL患者还表达LMP1。40%的患者可见pJAK1表达,而66.7%的患者可见pSTAT3表达[9]。Jiang等[10]还发现在EBV+DLBCL肿瘤标本中B7-H4和B7-H1阳性率高(84.62%和100%)。尤其B7-H1过表达与其肿瘤侵袭性相关,而当B7-H1表达减弱时,B7-H4成为EBV+DLBCL患者预后影响因素。

1.2EBV阳性DLBCL的实验室检查

利用外周血液体活检技术作为诊断,是判断疗效预后的新手段。近期研究表明在EBV相关淋巴瘤,如结外NK/T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤及鼻咽癌中,EBVDNA拷贝数和EBV血清抗体谱较EBER更为方便精准[11,12]。

1.2.1EBVDNA拷贝数

Okamoto教授对DLBCL患者的预处理血清中EBVDNA负荷进行检测,发现EBVDNA阳性患者较EBVDNA阴性患者有更差的生存率。2015年Okamoto等[13]对该研究进一步扩大样本并量化分析127例患者血清EBVDNA,检测其拷贝数的中位值为7.5×103拷贝/μg。EBER阳性患者的EBVDNA载量明显高于EBER阴性患者,且在多达75%的EBER阳性患者血清中检测到EBVDNA。无论组织EBER状态如何,血清EBVDNA高负荷的患者无进展生存期和总生存期明显缩短。另有学者强调在全血样本中EBVDNA的检测意义。李建勇教授团队回顾性研究329例患者,分析其组织EBER与全血EBVDNA情况的一致性为92.8%,而当组织EBER和全血EBVDNA结合使用时,总体生存率的差异更为显著。监测其动态变化时,化疗3个周期后EBVDNA便可转为阴性更倾向于获得缓解[14]。Tisi等[15]报道了全血EBVDNA阳性患者的无进展时间和总生存期明显缩短。以上结果均表明,EBVDNA拷贝数并非EBER的简单替代,而且对于EBER而言,它可能是更方便灵敏的肿瘤生物标志物[14]。

1.2.2EBV血清抗体谱

目前鲜少有研究评估EBV抗体在DLBCL中应用价值。Ziarkiewicz等[16]在一项DLBCL队列研究中对54例DLBCL患者进行EBV相关抗体谱分析,绝大多数检测样品中都存在VCA-IgG和EBNA-IgG,而很少发现EA-IgG。EBV特异性抗体,无论类别和特异性如何,与DLBCL中EBV状态无关联,且均无预后价值。此外,EBNAIgG抗体的滴度随年龄增加而降低(EBNA-IgG阳性和EBNA-IgG阴性组的平均年龄分别为55.4岁和72.0岁,P<0.01)。与EBNA-IgG阴性患者相比,EBNA-IgG阳性患者较少发生结外淋巴结。有趣的是,保留了VCA-IgG的老年DLBCL患者中EBNA-IgG消失。慢性EBV感染的继发性EBNA-IgG阴性可在免疫功能低下的状态如HIV感染和恶性肿瘤中出现。因此,EBNA-IgG的丢失可能是老年DLBCL患者控制病毒能力降低的迹象[16]。

1.3EBV阳性DLBCL的分子生物学诊断

随着高通量测序技术的发展,EBV+DLBCL的基因组学研究已经得到全面有效的分析,人们对于EBV+DLBCL的认识已进入了一个新的阶段:从传统的形态学及免疫组织化学水平进入分子生物学水平。

1.3.1肿瘤基因组学

EBV+DLBCL的体细胞基因突变具有独特模式。Liu等[17]通过与COSMIC数据库的匹配分析发现,其主要的突变特征与通过同源重组的DNA双链断裂修复失败有关。突变等位基因肿瘤异质性(MATH)评分显示,EBV+DLBCL表现出广泛的肿瘤内异质性,且与AnnArbor分期和多个结外病变部位呈正相关。Kataoka等[18]则证实EBV阴性和阳性DLBCL在基因拷贝数改变(CNA)上数量相当,但EBV+DLBCL的结构变异(SV)数量却要多于EBV-DLBCL。EBV+DLBCL中最常见的突变基因是MYC,其在EBV+DLBCL中过表达且与IPI评分有关,提示预后不良(中位总生存期:16个月vs29个月,P<0.01)[19]。TET2和DNMT3A在EBV+DLBCL中存在高频突变,考虑EBV感染与DNA甲基化和去甲基化过程失控有关。此外,PD-L1/PD-L2的突变频率显著较高,而PD-L1/PD-L2与FAS的突变呈反比关系,表明这些分子在病毒感染肿瘤细胞免疫逃逸中起到不同作用[18]。EBV+DLBCL的基因表达谱特征为NF-κB和JAK-STAT通路的激活[20]。据报道,EBV基因产物(如LMP1)以配体依赖性方式激活NF-κB通路,并阻碍p16(CDKN2A编码)-Rb途径[18]。同时也解释了在EBV+DLBCL中CD79B,MYD88和CDKN2A突变的缺失。66.7%的EBV+DLBCL显示pSTAT3阳性,这表明EBV参与JAK-STAT通路激活。44.5%的EBV+DLBCL具有pSTAT3和MYC的共表达,提示MYC基因的改变与JAK-STAT通路激活相关[9]。

1.3.2肿瘤免疫微环境

另有学说表明,EBV+DLBCL与肿瘤免疫微环境的改变有关。EBV感染可能导致转化的B细胞的免疫调节活性发生变化,其中包括EBV+DLBCL中的抗原捕获、抗原呈递、肿瘤相关巨噬细胞和免疫检查位点,从而导致临床上观察到预后不良表型。在抗原呈递方面,李小秋团队发现与EBV-DLBCL相比,EBV+DLBCL患者的Ⅱ类主要组织相容性复合物(MHCⅡ)和MHCⅡ反式激活剂(CIITA)表达明显降低。在EBV+DLBCL中涉及CIITA的遗传改变也更为常见,其分裂事件为23%,缺失事件为6%。在抗原捕获方面,EBV+DLBCL的B细胞受体BCR信号(pBTK)显著降低[21]。在肿瘤相关巨噬细胞方面,Keane等[22]则在390例患者的队列研究中应用NanoString平台比较宿主基因表达,发现EBV+DLBCL中的CD163基因表达水平显著较高。且CD163/CD68比率(M2巨噬细胞特异性标签)也与EBV+DLBCL相关,高水平的M2巨噬细胞患者预后较低水平患者更差。另一个重要的发现是,EBV+DLBCL的免疫检查点失调。首先,金静霞及李小秋等均报道了程序死亡配体1(PD-L1)的上调在EBV+DLBCL中肿瘤细胞上更为频繁[21,23]。随后,Ishikawa等[24]在10例EBV+iDLBCL患者中,发现有2例在肿瘤细胞上表达PD-L1,其余8例在微环境免疫细胞上表达PD-L1。相对地,仅有1例EBV-DLBCL(1/49)具有肿瘤性PD-L1表达。在EBV+DLBCL中,表达肿瘤性PD-L1的患者具有预后不良的临床表征。除了PD-L1/L2,Keane等[22]发现其他免疫检查位点基因例如LAG-3和TIM-3也与EBV+DLBCL密切相关。

2、EBV阳性DLBCL的临床治疗展望

2.1化疗

随着利妥昔单抗的问世,DLBCL患者在利妥昔单抗联合化疗(R-CHOP)治疗下的预后显著提高。Beltran等[25]将EBER+DLBCL患者使用联合利妥昔单抗治疗与否进行比较,发现R-CHOP治疗组相较于CHOP治疗组化疗疗效显著较好(59%vs33%,P<0.05)。但随着利妥昔单抗的普及,Castillo等[6]研究团队发现,即使在R-CHOP标准治疗下,EBER+患者仍具有较差的化疗反应(客观缓解率:50%～90%,完全缓解率:30%～70%)以及不良生存预后(5年生存率:54%)。

2.2抗病毒治疗

典型的抗病毒疗法对于根除慢性和转化B细胞中的EBV无效。Ganciclovir(更昔洛韦)和Acyclovir(阿昔洛韦)具有抗病毒能力,它们针对裂解相的蛋白质具有活性,但是EBV在感染B细胞的细胞中保持潜伏状态。因此,对于EBV有效抗病毒治疗首先需将EBV诱导进入裂解阶段。裂解期的诱导剂包括甲基化酶转移酶抑制剂,组蛋白脱乙酰基酶抑制剂和蛋白酶体抑制剂[26]。Romidepsin为Ⅰ类组蛋白脱乙酰基酶抑制剂。一项研究显示Romidepsin可有效诱导EBV进入裂解阶段,并增强了更昔洛韦介导的肿瘤细胞杀伤效果[27]。不仅如此,Romidepsin可以通过双重阻断LMP1和c-myc表达来诱导EBV+DLBCL肿瘤细胞裂解,并在动物模型上得到验证,但其临床疗效尚待证实[28]。

2.3通路抑制剂

NF-κB和JAK-STAT通路的激活被认为是EBV+DLBCL的表达谱特征[20]。一方面,NF-κB通路有望成为EBV+DLBCL靶向治疗的新靶点。蛋白酶体抑制剂Bortezomib联合CAL-101(一种p110δ特异性抑制剂)可以抑制NF-κB活性降低EBV+B细胞淋巴瘤细胞耐药性[29]。Lenalidomide也是抑制IRF4和NF-κB途径靶向药物。一项前瞻性研究表明在初诊DLBCL中将Lenalidomide添至R-CHOP中取得一定疗效,与R-CHOP同时或作为R-CHOP的维持[30]。Ibrutinib是Bruton酪氨酸激酶的抑制剂,也是B细胞受体(BCR)途径的重要组成部分抑制剂。在一项对80例难治性/复发性DLBCL患者的研究中,Ibrutinib在ABC型DLBCL(BCR/NF-κB为其主要激活通路)和GCB型DLBCL中诱导获得客观缓解率分别为37%和5%[31]。另外有一项评估EBV+DLBCL中的Ibrutinib和R-CHOP的Ⅱ期研究(NCT02670616)正在进行中。另一方面,JAK/STAT途径抑制剂可能成为EBV+DLBCL的另一种靶向治疗方法。Ruxolitinib是Janus激酶(JAK)1/2的抑制剂。Onozawa等[32]证实了Ruxolitinib在EBV阳性T细胞系中抑制磷酸化的活性STAT3并诱导其凋亡。

2.4免疫治疗

当下,PD-L1是具有重要治疗意义的免疫检查位点。PD-L1的上调是通过失活抗肿瘤T细胞反应而逃避多种癌症的机制。一项大样本研究中(n=1557)分析了肿瘤细胞的PD-L1和微环境中PD-L1(mPD-L1)的表达,在EBV+DLBCL患者中分别有16%和41%的患者有PD-L1和mPD-L1表达[33,34]。另有基础研究表明,PD-1的阻断效应与在PD-L1阳性的EBV+DLBCL中T细胞增殖和活化恢复有关[35]。因此,针对PD-1/PD-L1途径或将成为EBV+DLBCL的潜在免疫治疗方法。目前有两项正在进行中的研究,分别为应用PD-L1抑制剂durvalumab(NCT03212807)和PD-1抑制剂nivolumab联合EBV特异细胞毒性T细胞(NCT02973113)治疗难治性EBV相关淋巴瘤。

针对肿瘤相关标记物(如CD19)的嵌合抗原受体(CAR)T细胞淋巴瘤已为淋巴瘤患者提供了有效治疗策略。在一项研发鼻咽癌EBV相关LMP1定向CAR-T细胞中,Tang等[36]发现CD137共同刺激优化了LMP1特异性CAR-T细胞体内和体外抗肿瘤作用,为EBV感染相关的恶性肿瘤的CAR-T细胞功效提供了新方向。因此,免疫疗法能为EBV+DLBCL患者提供一种有效的替代治疗选择。

3、总结与展望

EBV+DLBCL是一类与EBV感染相关的侵袭性B细胞淋巴瘤,EBER被普遍认为是EBV+DLBCL诊断的金标准。但EBV+DLBCL在不同种族背景下有不同预后结局。因此,对于中国DLBCL患者在病理样本中应常规进行EBER检测。此外,EBVDNA拷贝数、EBV血清抗体谱和EBV+DLBCL分子生物学特征可作为EBV+DLBCL重要辅助检测手段,在动态监测疗效、评估预后、选择治疗靶点等方面有特殊应用价值。在临床治疗上,利妥昔单抗联合化疗治疗EBV+DLBCL的疗效仍较EBV-DLBCL差,伴随显著不良预后。而随着对EBV+DLBCL分子生物学的研究不断地深入,我们可以从多角度思考EBV+DLBCL治疗新方向。但由于EBV+DLBCL样本量限制,临床上亟需更大病例数关于EBV+DLBCL靶向疗法的前瞻性研究来评估其最佳治疗策略。

参考文献：

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