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抗沉默功能蛋白1B在结直肠癌中表达及与患者生存预后之间关系

2024-11-21 39 上传者：管理员

摘要：目的：采用生物信息学分析抗沉默功能1B组蛋白伴侣(ASF1B)在结直肠癌中的表达水平及其与临床预后和生物学功能的关系。方法：利用TCGA数据库和GEO数据库分析ASF1B在结直肠癌及其癌旁正常组织中的表达情况，并分析ASF1B表达与结直肠癌患者预后关系；利用HPA数据库分析ASF1B在结直肠癌中的蛋白表达情况；使用仙桃学术网站及R语言分析ASF1B表达与结直肠癌患者临床病理特征、预后的关系；利用基因功能注释富集分析探索ASF1B在结直肠癌中参与的信号途径。结果：与癌旁组织相比，结直肠癌组织中ASF1B的表达水平明显上调。ASF1B高表达与结直肠癌患者总体生存期和无进展间隔期呈显著正相关性；ASF1B高表达与肿瘤分期(T)、淋巴结转移(N)、远处转移(M)、CEA水平、淋巴结侵袭及神经侵袭存在明显相关性。Cox回归分析显示ASF1B高表达是结直肠癌患者总生存期的独立危险因素。ROC分析显示，ASF1B在结直肠癌中具有较高的诊断价值。功能富集分析显示，ASF1B与细胞周期、DNA修复、Mcm信号途径等显著相关。此外，共表达基因相关性分析显示ASF1B与周期相关基因、转录因子等显著正相关。结论：ASF1B在结直肠癌中高表达，并与结直肠癌患者的预后和发生发展存在一定相关性，其可能成为结直肠癌患者预后的生物标志物。

关键词：
抗沉默功能1B组蛋白伴侣
死亡率
细胞周期
结直肠癌
预后
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结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是全球范围内第三大常见恶性肿瘤，也是全球男性和女性癌症相关死亡的第三大原因。其发病率和死亡率在全球范围内居高不下，五年生存率为65%[1],男性的发病率和死亡率比女性高25%[2],且近年来早发性结直肠癌发病率呈上升趋势。尽管在治疗和预防方面取得了一定进展，但结直肠癌的预后仍然不容乐观。早期诊断和更好的预后与较低的死亡率有关，诊断性生物标志物是早期发现和预测治疗的关键，可用于风险分层和早期发现。因此，迫切需要寻找新的早期诊断性生物标志物，从而降低结直肠癌的死亡率，延长患者总生存期。

抗沉默功能蛋白1(anti-silence function 1, ASF1)是一种保守的H3-H4组蛋白伴侣蛋白，在DNA复制、DNA损伤修复和转录调控中发挥重要作用[3]。在哺乳动物中，ASF1由两个同源蛋白ASF1A和ASF1B组成。既往研究表明ASF1B在多种肿瘤中表达失调，且与肿瘤进展和转移有关[4-5]。然而，关于ASF1B在结直肠癌中的表达、预后价值及临床相关性，目前还尚不清楚。本研究利用生物信息学分析了ASF1B在结直肠癌中的表达水平与生存预后、临床病理的关系，探讨了ASF1B参与的相关生物学功能和信号途径，及其共表达基因相互作用情况，以期为结直肠癌的早期诊断和治疗提供理论依据。

1、材料和方法

1.1数据获取与处理

从癌症基因组图谱(the cancer genome atlas, TCGA, https: //www.cancer.gov/ccg/)数据库下载肿瘤相关RNA-seq数据，其中包含非配对结直肠癌(COADREAD)组织样本647例，癌旁组织51例；配对样本50例。利用仙桃学术(https: //www.xiantaozi.com/)在线工具分析ASF1B在TCGA-COADREAD样本中的表达水平，删除临床信息缺失的样本。从基因表达综合数据库(gene expression omnibus, GEO, https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载结直肠癌相关芯片数据集中的mRNA表达，通过R“limma”包鉴分析差异表达基因，标准为|log2FC|≥1,P<0.05,并进行可视化分析，所有基因的表达值已归一化。通过人类蛋白质表达谱数据库(the human protein atlas, HPA, https: //www.proteinatlas.org/)下载并评估ASF1B分别在结直肠癌和正常结肠组织中的免疫组织化学染色结果。

1.2 ASF1B的临床病理联系

从TCGA数据库下载结直肠癌患者的临床病理特征和预后信息。利用R(3.6.3版本)软件“ggplot2”包分析并可视化，包括TNM分期、病理分期、癌胚抗原(CEA)、淋巴侵袭和神经浸润等情况。

1.3 ASF1B的预后和诊断价值分析

采用R“survival”软件包分析TCGA结直肠癌数据资料，分析总体生存期(overall survival, OS)、疾病特异性生存期(disease specific survival, DSS)和无进展间隔期(progress free interval, PFI),使用“survminer”和“ggplot2”软件包进行可视化。使用“pROC”包进行对数据进行受试者工作特征(receiver operator characteristic, ROC)曲线分析，结果用“ggplot2”包进行可视化，评估ASF1B在结直肠癌中的诊断价值。

1.4基因功能注释和GSEA分析

为了研究与ASF1B相关的关键信号通路和生物学过程，从cBiportal数据库(http: //www.cbioportal.org/)“Co-expression”模块获取TCGA结直肠癌数据库中与ASF1B表达正相关的共表达基因集，用Metascape在线网站(https: //metascape.org/)进行基因功能富集分析。使用R“DESeq2”包获取TCGA结直肠癌中ASF1B相关的差异表达基因，根据ASF1B的表达水平将结直肠癌TCGA患者分为高、低两组，用“clusterProfiler”包对差异基因进行Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)分析。

1.5基因共表达分析

利用GEIPA 2数据库、cBiportal数据库和COXPRESdb数据库(https: //coxpresdb.jp/)获取与ASF1B正相关的基因并取交集。

1.6统计学分析

采用R3.6.3软件进行统计学分析。分析前对所有RNA-seq数据进行log2转换。利用卡方检验或Mann-Whitney U检验比较两组患者临床特征的差异。采用单因素和多因素Cox回归分析和Log-rank检验评价ASF1B在结直肠癌中的预后价值。P<0.05认为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 ASF1B在不同类型肿瘤及结直肠癌中的表达情况

非配对和配对样本与正常对照比较显示ASF1B在结直肠癌组织中表达显著上调(P<0.001,图1A、B)。GEO数据集GSE8671和GSE24514中ASF1B在结肠癌组织中的表达也显著上调(P<0.001,图1C、D)。免疫组织化学检测发现ASF1B在结直肠癌组织中的蛋白表达显著增高。

图1 ASF1B在结直肠癌组织中的表达情况

注：与正常对照组比较，***P<0.001。

2.2 ASF1B表达与结直肠癌患者临床病理特征的联系

ASF1B表达与结直肠癌患者TNM分期、病理分期、CEA水平、淋巴浸润、神经浸润和总生存期均有关。T4期患者的ASF1B表达水平显著低于T1、T2和T3期(P<0.05);与正常对照相比，ASF1B表达在N0、N1和N2期明显升高(P<0.001),在M0期和M1期的表达水平也不同程度升高(P<0.001),而发生远处转移患者组ASF1B表达水平显著低于未发生远处转移组(P<0.05),在病理I、II、III和IV期也较正常对照组表达上调(P<0.001)。此外，ASF1B高表达与结直肠癌患者的血清CEA水平、淋巴浸润、神经浸润和总体生存期也显著相关(P<0.001)。

2.3 ASF1B在结直肠癌中的生存预后分析

根据中位表达值将ASF1B在TCGA结直肠癌数据库中的表达分为低表达和高表达组，通过Kaplan-Meier生存曲线分析ASF1B表达与两组患者预后的关系，以确定ASF1B是否可作为结直肠癌的预后生物标志物。结果显示，ASF1B高表达与结直肠癌患者的OS(HR=0.70,P=0.043)和PFI(HR=0.68,P=0.017)良好预后相关，而与DSS(HR=0.73,P=0.164)相关性较低(图2A-C)。

图2 ASF1B表达在结直肠癌患者中的生存预后分析

2.4单因素-多因素Cox回归分析ASF1B的预后价值

单因素Cox回归分析结果显示，ASF1B表达与结直肠癌患者预后显著相关，且年龄、T、N、M、分期、血清CEA水平以及淋巴浸润均可作为预后因素；多因素Cox回归分析提示，年龄和ASF1B可以作为结直肠癌患者的独立预后因素(P<0.05)。根据多因素Cox比例风险模型构建预后列线图(Nomogram),结果显示预后列线模型表现良好，C-指数高达0.890(0.857-0.922),可作为结直肠癌患者预后评价的有效工具。此外，预后校准曲线显示，预测生存率和实际生存率在1年、3年和5年高度一致，表明风险评分的预后列线模型图可以更好地预测OS。

2.5 ASF1B在结直肠癌中的诊断价值

利用受试者工作特征(ROC)曲线分析ASF1B的诊断价值。ROC曲线下面积(area under ROC curve, AUC)为0.905(95% CI=0.872-0.937),结果表明ASF1B对结直肠癌患者具有极高的诊断价值，提示ASF1B可能是一种潜在的诊断生物标志物。

图3 ASF1B基因功能注释分析

2.6基因功能注释和GSEA富集分析

使用cBiportal数据库获取TCGA结直肠癌数据库中的ASF1B共表达基因，基于Metascape的功能富集分析结果显示，这些共表达基因优先参与细胞周期、有丝分裂细胞周期、DNA代谢过程的调节及细胞周期改变等(图3)。进一步利用GSEA功能富集了解ASF1B在结直肠癌发生发展过程中参与的信号通路分析结果显示，ASF1B基因在结直肠癌中主要参与PCNA依赖的切除修复、DNA错配修复、Mcm途径、G1期特异性转录及蛋白酶体途径等通路。

2.7 ASF1B共表达基因相关性分析

为了分析在结直肠癌中可能与ASF1B存在相互作用的基因，分别从GEIPA2、cBiportal和COXPRESdb数据库获取与ASF1B正相关的50个共表达基因并取交集。结果显示，共筛选出12个基因，即RNASEH2A、FEN1、CDCA5、MCM2、POLA2、CDCA8、TK1、RAD51、CDC45、ORC1、GINS2和RAD54L与ASF1B共表达；相关性分析表明ASF1B与其具有良好的相关性(P<0.001);分析TCGA数据结果显示，与癌旁正常组织相比，上述共表达基因在结直肠癌组织显著高表达(P<0.001)。

3、讨论

结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率在全球范围内居高不下，成为全球的重大健康问题。近年来，虽然手术、放疗、化疗等治疗手段不断改进，但结直肠癌的预后仍然不容乐观。因此，寻找新的生物标志物以了解其与患者生存预后之间的关系对于结直肠癌的早期诊断和治疗具有重要意义。

ASF1B是一个与染色质重塑和DNA复制相关的基因，主要通过染色质功能调控影响DNA复制、DNA损伤修复和转录过程，对维持染色质稳态和基因表达具有重要作用。近年来，多项研究表明ASF1B在多种肿瘤中表达异常[4-5],其高表达与肿瘤的恶性程度、不良预后、侵袭转移、细胞周期调控和耐药等密切相关，ASF1B可能通过多种机制参与了肿瘤的发生和发展。

本文首先通过公共数据库的生物信息学技术分析发现ASF1B的mRNA和蛋白表达水平在结直肠癌组织中显著增加，表明ASF1B可能在结直肠癌的发生和发展中起到重要的作用，这与先前关于ASF1B在泛癌中表达升高的研究一致[4]。且ASF1B的高表达与结直肠癌的TNM分期、淋巴浸润和神经浸润等密切相关，与结直肠癌患者总体生存期和无进展间隔期的良好预后相关，提示ASF1B可能作为结直肠癌患者生存预后的一个重要潜在生物标志物。此外，单因素和多因素Cox回归分析表明ASF1B可作为结直肠癌患者生存预后的独立危险因素，具有重要预后价值。此外，ROC曲线分析显示ASF1B表达对结直肠癌患者的诊断评估具有一定的预测价值。

ASF1B蛋白是调控细胞周期激酶类的底物[6]。细胞周期激酶在调节染色质核小体结构中发挥关键作用，通过确保核小体组装位点组蛋白的持续供应，同时直接与转录调节因子相互作用[7]。既往研究报道ASF1B作为癌基因通过参与细胞周期促进肿瘤生长[8]。ASF1B作为哺乳动物ASF1组蛋白H3-H4伴侣蛋白的亚型之一，在有丝分裂过程中起着关键的组蛋白受体/供体的作用。ASF1B的缺失可能导致S期染色质组装受损[9]。通过基因功能注释和GSEA富集分析发现，高表达的ASF1B可能参与了多种与肿瘤发生和发展相关的生物学过程和信号通路，包括细胞周期调控、DNA修复、错配修复、MCM信号途径、E2F靶点、G2M检查点、细胞凋亡等。E2F转录因子家族是参与细胞G1-S周期的重要细胞因子之一，其异常在肿瘤发生中起作用。此外，E2F转录因子也被发现调控ASF1B。这些结果进一步支持了ASF1B在结直肠癌中的重要作用。最后，本文从GEPIA、cBiportal和COXPRESdb三个数据库分别获取了与ASF1B共表达或相似的基因，取交集发现有12个共同的基因。进一步通过ASF1B共表达基因的相关性分析，发现ASF1B与多个与肿瘤发生和发展相关的基因呈正相关。这些基因包括细胞增殖相关基因、转录因子、信号通路调控因子等。这表明ASF1B可能通过与这些基因的相互作用参与了结直肠癌的发生和发展。

综上所述，本研究通过生物信息学分析发现ASF1B在结直肠癌中的高表达与患者良好生存预后之间存在一定的关系。这一发现为进一步研究ASF1B在结直肠癌中的功能和机制提供了新的线索，有望为结直肠癌的诊断和治疗提供新的靶点和策略。然而，还需要更多的实验研究来验证这一发现，并进一步揭示ASF1B在结直肠癌中的作用机制，寻找ASF1B作为治疗靶点的潜力，为改善结直肠癌患者的预后和生活质量提供新的策略。

基金资助:贵州省卫生健康委员会项目(GZWKJ2022-298);贵州中医药大学学术新苗项目(贵科合学术新苗[2023]-05号);贵州省高等学校工程研究中心项目(黔教技[2023]037号);贵州省科技计划项目(黔科合基础-zk[2023]一般437);

文章来源:刘燕青,张石宇,吴文宇,等.抗沉默功能蛋白1b在结直肠癌中的表达及其与患者生存预后之间的关系[j].微量元素与健康研究,2024,41(06):1-4+30.