首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 耳鼻咽喉科论文 > 鼻疾病论文 > 拷贝数变异测序在检测胎儿鼻骨发育不良结果中的应用研究

拷贝数变异测序在检测胎儿鼻骨发育不良结果中的应用研究

2024-06-27 116 上传者：管理员

摘要：目的探讨拷贝数变异测序(CNV-seq)应用在胎儿鼻骨发育结果检测的临床价值。方法选取2018年8月至2019年12月在广州市妇女儿童医疗中心柳州医院进行产前超声筛查发现胎儿鼻骨发育异常的孕妇160例为研究对象，比较染色体核型分析和CNV-seq技术检测结果差异。结果染色体核型分析检测出39例染色体异常，其中常染色体数目异常32例，性染色体异常5例，染色体结构异常2例；CNV-seq检测出16例染色体异常，其中多态性9例，明确致病性7例；年龄≥35岁孕妇羊水染色体核型异常检出率高于年龄<35岁孕妇，且在年龄≥35岁孕妇中，羊水染色体核型异常检出率高于CNV-seq检测(χ2值分别为15.856、20.928,P<0.05);胎龄<24周羊水染色体核型异常检出率高于胎龄≥24周，且在胎龄<24周中，羊水染色体核型异常检出率高于CNV-seq检测(χ2值分别为16.979、16.311,P<0.05);产前诊断指征2项及以上者羊水染色体核型异常检出率高于2项以下者，而CNV-seq异常检出率明显低于2项以下者(χ2值分别为9.246、10.338,P<0.05);在产前诊断指征2项及以上者中，羊水染色体核型异常检出率高于CNV-seq检测(χ2=27.655,P<0.05)。结论在产前超声筛查出胎儿鼻骨发育异常的孕妇中，CNV-seq有较好的应用价值，可弥补染色体核型分析的不足，有助于染色体结构异常的检出。

关键词：
拷贝数变异测序
染色体核型分析
胎儿
鼻骨发育不良
鼻骨测量
加入收藏

随着产前诊断技术的不断发展，胎儿鼻骨测量已经成为孕早期及中期的常规检查项目。研究表明，在核型正常的胎儿中，胎儿鼻骨发育不良的发生率约为0.5%～4.5%[1]。众所周知，鼻骨发育不良与胎儿染色体异常有关，例如与13、18、21三体综合征和Turner综合征有关，尤其与21三体综合征的关系密切[2,3,4]。此外，胎儿的一些罕见疾病也与鼻骨发育不全有关，例如Cri du chat(5p-)综合征、Wolf-Hirschhorn综合征(4p-)和Fryns综合征等[5]。基于细胞遗传学的染色体核型分析技术可以通过直接观察染色体来检测染色体的数目和结构变化，但不能直接检测基因组DNA的变化，因其不仅分辨率低、流程复杂、报告周期长，报告结果还受医师经验的影响[6]。因此，有必要开发新的高效筛查技术，以提高染色体异常的检出率。拷贝数变异测序(copy number variations sequencing, CNV-seq)分析是一种对样本进行测序分析的方法，将测序结果与人类参考基因组进行比较，通过生物信息学分析发现拷贝数变异(copy number variations, CNV)。CNV-seq不仅可以检测染色体核型分析覆盖的染色体变异，还可以检测芯片探针无法覆盖的染色体微缺失和微重复，检测成本低、通量高、重复性好[7]。本研究旨在对比染色体核型分析，进一步探索CNV-seq应用于鼻骨发育不良检测的临床价值。

1、资料与方法

1.1一般资料

选取2018年8月至2019年12月在广州市妇女儿童医疗中心柳州医院进行产前超声筛查的160例孕妇为研究对象。纳入标准：超声筛查发现鼻骨发育异常；研究对象均了解本研究并签署知情同意书。排除标准：①产前诊断禁忌症；②近1个月内有外源DNA的免疫治疗；③近1年内有输血史；④接受过移植手术、肝细胞治疗。最终纳入孕妇年龄为18～43岁，孕龄为孕11～30+6周。本研究经过医院伦理委员会批准(批号：20180801)。

1.2检测方法

1.2.1染色体核型分析

对入组的孕妇进行遗传咨询，根据孕周采取相应产前诊断方法：孕11～13+6周行绒毛膜穿刺术，孕14～26周者行羊膜腔穿刺术，孕周≥27周行脐静脉穿刺术。标本收集后进行培养、制片、消化及染色等，之后进行常规G显带分析。利用染色体自动扫描系统扫描玻片，挑选分散良好、条带清晰、至少达到320条带水平的中期分裂相进行分析，每个病例计数25～30个分裂象、分析≥5个核型，如发现异常，则增加计数和分析数量。

1.2.2 CNV-seq检测

使用DNA试剂盒提取基因组DNA。将提取的基因组DNA片段化，用衔接子末端连接，扩增以产生测序文库。测序在Illumina测序平台上进行。然后使用基因组变异数据库(Database of Genomic Variants, DGV)(http: //dgv.tcag.ca/dgv/app/homr)、集成资源(Database of Chromosomal Imba-lance and Phenotype in Humans Using Ensembl Resources, DECIPHER)的人类基因组变异和表型数据库(http: //decipher.sanger.ac.uk)、人类在线孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM)数据库(http: //www.omim.org)和加州大学圣克鲁斯分校数据库(University of California, Santa Cruz, UCSC)(https: //genome.ucsc.edu)进行分析。根据美国医学遗传学与基因组学学会(Ameri-can College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)指南[8,9],CNV的临床意义分为5个等级：致病性CNV、可能致病性CNV、临床意义不明性CNV、可能良性CNV、良性CNV。将所有致病性CNV、可能致病性CNV及大于1Mb的重复和大于500kb的缺失的临床意义不明性CNV列入统计。

1.3统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0软件。计数资料采用例数(n)和百分比(%)表示，组间差异比较使用χ2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1羊水染色体核型分析结果

160例羊水细胞经检测发现，39例染色体异常，见表1。

2.2 CNV-seq检测结果

经CNV-seq检测，共检出染色体结构异常16例，见表2。其中7例明确致病性结果的具体基因见表3。

表1羊水染色体核型分析结果

表2 CNV-seq检测结果

表3 7例明确致病性结果

2.3不同孕妇染色体异常检出率比较

年龄≥35岁孕妇羊水染色体核型异常检出率高于年龄<35岁孕妇，且在年龄≥35岁孕妇中，羊水染色体核型异常检出率高于CNV-seq检测(χ2值分别为15.856、20.928,P<0.05);胎龄<24周羊水染色体核型异常检出率高于胎龄≥24周，且在胎龄<24周中，羊水染色体核型异常检出率高于CNV-seq检测(χ2值分别为16.979、16.311,P<0.05);产前诊断指征2项及以上者羊水染色体核型异常检出率高于2项以下者，而CNV-seq异常检出率明显低于2项以下者(χ2值分别为9.246、10.338,P<0.05);在产前诊断指征2项及以上者中，羊水染色体核型异常检出率高于CNV-seq检测(χ2=27.655,P<0.05),见表4。

表4不同孕妇染色体异常检出率比较[n(%)]

3、讨论

相关数据统计，我国新生儿出生缺陷发生率高达5.6%,其中约有25%的出生缺陷与染色体异常及基因缺陷等遗传因素相关[10]。因此，预防和发现先天性缺陷的胎儿是产前筛查与诊断的重要任务。目前，产前筛查和诊断可采取的主要方法有妊娠早/中期的血清学检查、超声影像检查和无创DNA检查等[11]。近年来，随着影像学及分子生物学领域的不断进步，用于产前筛查和诊断胎儿结构畸形及染色体异常的技术水平也在不断提高。

3.1 CNV-seq检测结果与鼻骨发育不良的关系

许多CNV在人群中是良性变异，但仍然存在不少的致病拷贝数变异，并导致基因组疾病[12]。鼻骨发育不良可能是与临床CNV相关的面部畸形的客观标志物[2]。常规染色体核型分析是目前用于检测胎儿染色体数量和结构异常的金标准。然而，这种方法有一定的局限性，例如分辨率有限，可能导致<5Mb的染色体结构异常无法辨别诊断[13]。CNV-seq主要是通过有效检出遗传物质增减即基因拷贝数量变化而实现对染色体异常情况进行筛查的目的。CNV-seq技术可对母亲羊水中的循环游离DNA进行测序，并且在筛查具有高灵敏度和特异性的胎儿染色体非整倍性检测领域非常成熟[14]。与传统的染色体核型分析相比，CNV-seq提供了更高分辨率分析，可以准确可靠地诊断具有临床意义的CNV。CNV-seq还存在许多潜在的优势，包括高通量样品分析、更低的基因组DNA(genomic DNA,gDNA)输入检测和更短的周转时间等[15,16]。另外，有研究显示，CNV-seq相对于染色体核型分析的CNV检出率提高了约1%,并首次提出CNV-seq可被视为检测致病性CNV的一级诊断技术[17]。甚至还有建议提出，可通过受累器官系统和观察到的异常数量将超声检出异常胎儿的致病性CNV频率做进一步的细化分析。

3.2引起胎儿鼻骨发育不良的CNV主要因素

我们的研究发现，引起胎儿鼻骨发育不良的CNV主要是常染体数目异常，其中21三体占比最高，与前期研究结果一致[18]。相较于染色体核型分析，CNV-seq针对引起CNV的染色体结构异常的临床检出率更高。表明相较于染色体核型分析，CNV-seq能够有效降低胎儿染色体结构异常性疾病的漏诊率。随后我们针对该结果进行了不同年龄、胎龄、产前诊断指征的亚组分析，发现年龄≥35岁、胎龄<24周及产前诊断指征2项及以上羊水染色体核型分析染色体异常检出率显著高于<35岁、≥24周和产前诊断指征2项以下的羊水染色体核型分析染色体异常检出率。且在年龄≥35岁、胎龄<24周及产前诊断指征2项及以上的孕妇中，羊水染色体核型分析的染色体异常检出率高于CNV-seq检测。而产前诊断指征2项以下CNV-seq异常检出率明显高于2项以上。以上结果表明年龄≥35岁、胎龄<24周及产前诊断指征2项及以上的孕妇可能更容易发生染色体数目异常，产前诊断指征2项以下的孕妇可能更容易发生染色体结构异常。染色体结构异常主要包括染色体易位、倒位、衍生、插入等。当染色体发生变异继而断裂时，会出现不同染色体的易位、重排和重新连接等，从而在修复过程中形成新的衍生染色体[19,20]。如果衍生染色体在断点处表现出片段缺失或基因损伤，即为不平衡易位和/或倒置。染色体结构异常通常没有基因的增减，但也存在染色体微小片段的重复或缺失，并且其位置效应及一些功能基因的断裂，很有可能影响基因的表达及调控[21]。虽然特异性微缺失和微重复很少见，但在致病性CNV中比全染色体非整倍性中的异常更常见，并且可以具有相同或更严重的表型[22]。另有研究显示，高龄孕妇、多项产前诊断指征及胎龄较小者染色体异常发生率较高，并且随着母体年龄增长生成畸形配子的概率增加，易发生染色体不分离导致胎儿染色体“三体”疾病[23,24,25]。因此，CNV-seq针对染色体结构异常的检出率更高，范围更广泛。

综上所述，CNV-seq具有较好的应用价值，可弥补染色体核型分析的不足，有助于染色体结构异常的检出。

参考文献:

[10]李小敏,陆叶,罗迪美.基因组拷贝数变异测序技术在超声异常胎儿诊断中的应用[J].深圳中西医结合杂志,2020,30(21):78-80.

[11]彭亚琴,徐晶晶,胡月,等.核型分析联合拷贝数测序在颈项透明层增厚胎儿染色体异常中的应用研究[J].中华疾病控制杂志,2020,24(6):706-710.

[12]贾广珠.CNV-seq联合染色体核型分析在产前诊断中的应用研究[D].青岛:青岛大学,2020.

[15]范新萍,岳育红,龚丽芸,等.染色体核型分析联合拷贝数变异测序技术在产前诊断中的应用研究[J].中国医刊,2022,57(7):762-767.

[21]时盼来,侯雅勤,陈铎,等.应用CNV-seq技术分析217例鼻骨发育不良胎儿的基因组拷贝数变异[J].中华医学遗传学杂志,2022,39(10):1076-1079.

[22]孙雪晶,张俊梅,舒静,等.CNV-seq技术在流产组织遗传病因学中的临床应用价值[J].中国妇幼保健,2023,38(9):1700-1705.

[23]岳发贵.产前高频致病CNVs基因型-表型关系及复发性流产全基因组测序研究[D].吉林:吉林大学,2023.

[24]唐艳,卢守莲,王珏.染色体核型分析联合CNV-Seq检测在高龄孕妇产前诊断中的临床应用[J].系统医学,2022,7(15):164-168.

[25]王丽,符小艳,洪燕,等.小于胎龄且不伴结构异常胎儿染色体异常的研究[J].新医学,2020,51(7):553-557.

基金资助:广西壮族自治区卫生健康委员会科研课题(Z20180032);广西科技计划项目(广西妇产科疾病临床医学研究中心-桂科AD22035223);