在各类消化系统恶性肿瘤中，结直肠癌(colorectal cancer, CRC)的发病频率表现突出，其发生率较高，是全球第四大致命癌，每年约有90万人死于结直肠癌[1]。随着发展中国家的不断进步，导致人口饮食模式及构成改变，预计到2035年，全球结直肠癌的发病率将增加到250万[1]。另外，研究揭示结直肠癌在近年来呈现出明显的年轻化发病特征，50岁以下的结直肠癌患者持续增加[1,2]。因此，更好地了解结直肠癌发生的分子机制有助于结直肠癌的预防、诊断和治疗。赖氨酸乙酰转移酶8 (lysine acetyltransferase 8, KAT8) 是一种组蛋白乙酰转移酶，属于MYST(MOZ/YBF2/SAS2/Tip60)家族。研究发现，在胶质母细胞瘤病例中，KAT8蛋白表达水平显著增高，并且其高表达与患者的总体生存期呈现负相关性，即KAT8表达量越高，胶质母细胞瘤患者的整体预后越差[3]。此外，KAT8的乙酰化可以调控脂质代谢影响结直肠癌细胞的侵袭和迁移潜能[4]。但KAT8对结直肠癌细胞增殖的影响鲜有报道，因此，本研究旨在探究KAT8对结直肠癌细胞增殖的影响以及可能的分子机制。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 人体样本及细胞系：

人体样本已获得中国人民解放军总医院第一医学中心伦理委员会的审查批准书(S2016-057-02)及受试者签署的知情同意书。人正常结肠上皮细胞系CCD841, 人源结直肠癌细胞系HCT116、SW480、LoVo、LS174T和Caco-2, 人胚胎肾上皮细胞系HEK293FT(美国典型培养物保藏中心，American Type Culture Collection, ATCC)。

1.1.2 主要试剂：

DMEM高糖培养基(Gibco公司);胰蛋白酶、胚胎牛血清(Sigma-Aldrich公司);细胞总RNA提取试剂盒(上海奕杉生物科技有限公司);Lipo2000转染试剂盒(Invitrogen公司);Hifair Ⅲ 1st Str、cDNA Synthesis 反转录试剂盒、CCK8检测试剂盒和细胞裂解液(上海翊圣生物科技有限公司);PCR Mix (ABM公司);无内毒素小提试剂盒(天根生化科技有限公司);METTL3 抗体、actin抗体、 KAT8 抗体、N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)抗体(Cell Signaling Technology公司);荧光兔和鼠二抗-800通道(LI-COR公司);蛋白酶磷酸酶抑制剂(Roche公司);MG149 (Selleck公司)。

1.2 方法

1.2.1 访问在线平台：

通过访问GEPIA2在线平台,对TCGA数据库中结直肠癌患者的癌组织(n=275)和对应正常组织(n=41)中KAT8的表达水平进行对比分析，探究该基因在癌发生发展中的潜在作用。此外，利用UCSC Xena数据可视化与探索工具,可以进一步深度挖掘TCGA数据库资源，分析不同分期结直肠癌患者癌组织内KAT8的表达差异，以期揭示KAT8在结直肠癌不同进展阶段可能存在的表达模式及其与疾病进程的关系。在进行数据分析时，所有的表达量数据均经历了对数转换处理，即将原始数据转化为对数形式，并以每个数组的中位数为中心，进行标准差归一化。

1.2.2 使用cBioPortal:

分析TCGA数据库中结直肠癌组织 KAT8 与 METTL3基因表达情况， 将分析网站的数据在基因表达数据归一化处理后，采用Pearson correlation 统计学方法得出。

1.2.3 生信数据的分析：

利用R语言下载GEO数据库中GSE124551数据集和GSE17536数据集，clusterProfiler包进行基因集、通路富集分析，生存分析使用Survival包进行分析。

1.2.4 细胞培养：

HCT116与SW480细胞均采用DMEM培养液进行培养，该培养液内已添加了10%的胎牛血清和1%的青霉素-链霉素双抗混合物作为营养补充和抑菌剂。这两种细胞均在37 ℃、5%二氧化碳浓度的标准培养箱中进行恒温恒湿培养。

1.2.5 平板集落形成实验：

选取处于指数生长期、具备高增殖活性的肿瘤细胞群体。接着对这些细胞进行消化处理，利用酶解方法使其从贴壁状态脱离并转化为单细胞悬浮液。随后通过轻柔吹打确保细胞充分分散为单个状态，并进行精确计数；接种于6孔板培养板中各实验组接种700个细胞/孔，轻轻摇匀；于细胞培养箱中培养14 d后，移除上清液，用PBS小心浸洗2次。加入多聚甲醛对细胞进行固定30 min; 移除多聚甲醛，PBS洗涤1次，加适量结晶紫染色10 min; 用PBS洗涤细胞数次，晾干，并拍照。

1.2.6 CCK8法检测细胞增殖和活力：

在96孔板中接种细胞，2 000～4 000个/孔。MG149加药处理细胞：待细胞全部贴壁后，加入所需浓度的MG149,同时设置对照组，24 h后加入CCK8孵育2～4 h后对各孔在450 nm波长的吸光度值进行检测并分析。

1.2.7 ShRNA载体和过表达载体构建：

通过https: //www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/semi-configu-rators/shrna网站设计针对KAT8的短发夹干扰序列，KAT8-shRNA1: 5′-CGAAATTGATGCCTGGTATTT-3′;KAT8-shRNA2: 5′-GCAAGATCACTCGCAACCAAA-3′。将干扰序列退火后，将退火片段与pLKO.1载体(Ecor Ⅰ, Age Ⅰ酶切)连接，提取质粒并进行测序验证shRNA的准确性。利用Snapgene软件设计METTL3的特异性引物，以293FT细胞的cDNA为模板进行PCR,将PCR产物胶回收后，与pLX304载体(BsrgⅠ,NheⅠ酶切)连接，取质粒并进行测序验证METTL3过表达质粒的准确性。

1.2.8 慢病毒及细胞株的构建：

按照1∶2∶2的比例将质粒PMD2G、PSPAX2以及目标载体混合，并通过转染技术将其高效导入到293FT细胞中。在转染后6 h, 进行细胞培养液的更换操作。随后，在转染后的48 h和72 h两个时间点，分别收集并储备细胞上清液，使用0.45 μmol/L滤膜过滤细胞上清后，-80 ℃保存。将3×105数量的细胞接种于6孔培养板中，待细胞成功贴壁并稳定生长后，以新鲜全营养培养基与病毒液按1:2的比例混合，并将其添加至6孔板内。为了提升病毒感染效率，同时向其中加入适量的凝聚胺浓缩液(浓度为1 000×),确保细胞充分感染。在完成病毒感染48 h后，对细胞进行嘌呤霉素(终浓度为2 μg/mL)的选择性筛选处理。经过连续两代的筛选淘汰未感染或未稳定整合目的基因的细胞，最终获得稳定表达目标基因的细胞株。

1.2.9 RT-qPCR检测METTL3及其下游基因的mRNA表达水平：

将细胞接种于6孔板中，待细胞长满后，采用RNA提取试剂盒从细胞中提取总RNA;然后，利用反转录试剂盒对1 μg所提取的RNA进行反转录反应，生成cDNA。实验过程中，选择β-actin作为内参基因以校正实验误差。接下来，通过实时荧光定量PCR技术(real-time PCR),运用SYBR Green染料法，在实时PCR扩增仪上对目标基因以及内参基因进行扩增检测。最后，依据实时PCR结果，对相关基因的相对表达水平进行计算和分析。

1.2.10 Western blot 检测细胞相关基因的蛋白质表达水平：

将细胞接种于6孔板中，待细胞长满后，针对每孔内的细胞，采用300 μL的细胞裂解液来进行有效的细胞裂解处理。提取总蛋白质后进行BCA定量。配制15孔10%的SDS-PAGE凝胶并进行电泳分离，蛋白质上样量为20～40 μg/孔。电泳结束后，利用电转仪，使用NC膜，控制电流300 mA,湿转1.5 h。5%脱脂牛奶封闭后孵育一抗METTL3, KAT8和β-actin过夜。次日，首先将样本用TBST缓冲液进行3次充分洗涤，随后在室温条件下，对样本进行与一抗对应的二抗孵育操作，孵育时长设定为2 h, 再次用TBST清洗3遍后显影，并使用ImageJ对蛋白质相对表达量进行分析。

1.2.11 Dot blot 检测RNA中m6A修饰：

采用RNA提取试剂盒从细胞中提取总RNA并进行浓度测定，并将RNA用去离子水稀释至100 ng/μL;将RNA溶液逐滴滴加到核酸转移膜上，形成微小圆点，确保点样间距适中；将点好样的膜在室温下晾干；使用5%脱脂奶粉封闭膜1～2 h后，清洗膜并加入m6A抗体在4 ℃环境下孵育过夜；用TBST缓冲液充分洗涤膜3次，随后在室温条件下，进行二抗孵育，孵育时长设定为2 h, 再次用TBST清洗3遍后显影，分析各点的信号强度，并评估各个样品中m6A修饰的相对含量。

1.3 统计学分析

数据分析阶段，选用Prism 9.0软件作为工具进行处理。实验结果以平均值±标准差

表示。在评估两组数据间的均值差异时，采用了独立样本t检验统计方法进行比较分析，多组的组间比较利用单因素方差分析。

2、结果

2.1 KAT8在结直肠癌中高表达

与人结直肠癌癌旁组织相比，人结直肠癌组织中KAT8表达水平增高(P<0.05)(TCGA, 图1A);KAT8的表达水平随着结直肠癌患者的分期更晚而更高(P<0.05)(TCGA, 图1B)。 与人结肠上皮细胞系CCD841相比，人结直肠癌细胞系HCT116, SW480, LoVo, LS174T, Caco-2中KAT8表达水平显著增高(P<0.05)(图1C); 结直肠癌临床病例癌组织的KAT8表达水平也显著高于癌旁组织(P<0.05)(图1D)。

2.2 敲低或选择性抑制KAT8可以抑制结直肠癌细胞增殖

图1 KAT8在结直肠癌中的表达情况

设计两段具有特异性识别位点的shRNA用于构建KAT8敲低的细胞株。这两段shRNA均能有效地降低KAT8的表达水平(图2A)。基于此结果，这两条shRNA可用于后续关于KAT8功能机制的系列实验探究中。与对照组shNC相比，shKAT8组的HCT116和SW480细胞增殖速度明显减慢(P<0.05)(图2B,C),集落形成能力也明显减弱(图2E)。 KAT8特异性抑制剂MG149处理后，HCT116和SW480细胞活力明显降低(P<0.05)(图2D),集落形成能力也明显减弱(图2F)。

2.3 敲低KAT8降低RNA的N6-甲基腺苷(m6A)修饰水平

利用生物信息学分析探究KAT8敲低细胞及其对照细胞的差异表达基因，并对差异基因进行GO富集分析，发现多个差异基因参与RNA的合成和加工等过程(图3A);在HCT116细胞中，与对照组shNC相比， shKAT8组总RNA的m6A修饰水平降低(图3B)。在结直肠癌组织中，KAT8与mRNA去甲基化酶基因ALKBH5表达负相关(P<0.05)(TCGA, 图3C);KAT8与mRNA甲基化转移酶METTL14和WTAP的表达不相关(TCGA, 图3D,E),但是与另一种mRNA甲基化转移酶METTL3的表达正相关(P<0.05)(TCGA, 图3F),且METTL3高表达的结直肠癌患者生存期低于低表达结直肠癌患者(P<0.05) (GSE17536, 图3G)。

图2 敲低或选择性抑制KAT8对结直肠癌细胞增殖的影响

图3 下调KAT8对总RNA m6A修饰的影响

2.4 敲低KAT8抑制METTL3的表达

在HCT116和SW480这两种细胞中，与对照组shNC相比，shKAT8组的METTL3的蛋白表达水平降低(P<0.05)(图4A);在HCT116细胞中，与对照组shNC相比，shKAT8组的METTL3的mRNA表达水平降低，同时METTL3调控的一些下游基因(SOX2, HK2, SLC2A1, CCNE1)mRNA的表达水平也降低 (P<0.05)(图4B)。

2.5 过表达METTL3能够逆转敲低KAT8抑制的细胞增殖

在HCT116和SW480这两种细胞中，与对照组shKAT8相比， shKAT8-oe METTL3中METTL3表达量增高(图5A),且细胞增殖速度加快(P<0.05)(图5B,C)。此外，与对照组相比，MG149对METTL3过表达细胞增殖的抑制作用有所减弱(P<0.05)(图5D,E)。

3、讨论

KAT8,又名MYST1,是一种高度保守的组蛋白乙酰化转移酶，其与乳腺癌、卵巢癌、胃癌和非小细胞肺癌等多种肿瘤的发生和发展相关。最近研究发现，KAT8的乙酰化可以通过调控脂质代谢进而影响结直肠癌细胞的侵袭和迁移潜能[4]。然而，KAT8对结直肠癌细胞增殖的影响以及其在结直肠癌发生发展中的机制有待进一步研究。本研究结果显示，KAT8蛋白在结直肠肿瘤组织内的表达量相较于邻近的癌旁组织有明显的增高，并且结直肠癌细胞系的KAT8表达水平也显著高于结肠上皮细胞系，暗示其在该类癌的发生和发展过程中可能扮演着关键角色。为探究KAT8对结直肠癌细胞增殖的影响，本研究在结直肠癌细胞中敲低KAT8后发现，敲低KAT8的细胞增殖速度与对照组细胞相比显著减缓，提示KAT8对结直肠细胞的增殖具有重要的作用。

大量研究表明，KAT8与转录调控、凋亡、自噬和DNA损伤修复等多种细胞功能有密切的关系[5]。为进一步探究KAT8在结直肠癌细胞增殖过程中的潜在的作用机制，本研究通过对WT(wild type)和KAT8敲低的细胞的差异基因进行GO富集分析发现多个差异基因参与RNA的合成和加工等过程。M6A (N6-methyladenosine) 是真核生物RNA(rRNAs, tRNAs, mRNAs和lncRNAs等)中最普遍、最丰富和最保守的转录后修饰[6]。RNA m6A修饰参与调节RNA的剪接、翻译、稳定性和易位等，在包括肿瘤在内的多种疾病的发生发展中扮演着重要的角色[7,8]。本研究表明，敲低KAT8可以降低结直肠癌细胞的总RNA m6A修饰水平，提示KAT8可能通过调控RNA m6A修饰进而影响结直肠癌细胞增殖。M6A修饰由m6A甲基转移酶 (如METTL3/14和WTAP等)修饰，并由去甲基化酶 (包括ALKBH5和FTO)去除[9]。本研究通过探究KAT8与调控m6A修饰关键基因在人结直肠癌组织中表达的相关性，发现KAT8与ALKBH5和METTL3均存在相关关系且与METTL3的相关性更强，遂选择METTL3进一步研究。

图4 下调KAT8对METTL3表达的影响

图5 过表达METTL3对敲低KAT8细胞增殖的影响

本研究通过敲低KAT8后发现，METTL3及其调控的一些下游基因(SOX2, HK2, SLC2A1, CCNE1)的表达水平显著降低[10,11],提示KAT8可以通过调控METTL3及其下游基因的表达。此外，本研究发现过表达METTL3可以逆转由于KAT8敲低导致的细胞增殖速度降低，并且过表达METTL3也可以逆转MG149对细胞增殖的抑制作用，提示KAT8可以通过调控METTL3进而影响结直肠癌细胞的增殖。

综上所述，本研究揭示了KAT8在结直肠癌细胞增殖进程中具有显著功能影响，并指出KAT8通过调节METTL3所介导的m6A修饰过程，在促进结直肠癌细胞增殖中起着关键作用。这一发现为结直肠癌治疗策略的创新与拓展提供了新的理论依据和可能的方向。

参考文献:

[2]张梦迪,王亚南,李杰,等.雷帕霉素下调mTOR-GP73通路抑制结直肠癌进程[J].基础医学与临床,2020,40:934-939.

[8]廖镇城,杨思懿,吴平安.提高m6A去甲基化酶FTO表达抑制鼻咽癌细胞增殖[J].基础医学与临床,2024,44:57-62.

基金资助:国家自然科学基金(81800552); 军队医学科技青年培育计划-孵化项目(21QNPY108); 中央高校基本科研业务费(3332023150);

文章来源:张鹏举,李杰,张梦迪,等.KAT8通过增强METTL3表达促进结直肠癌细胞系增殖[J].基础医学与临床,2024,44(07):931-939.