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mSEPT9检测在结直肠癌诊断和复发监测中的价值

2024-07-08 27 上传者：管理员

摘要：目的:探讨Septin9基因甲基化(Septin9 gene methylation, mSEPT9)检测在结直肠癌(colorectal cancer, CRC)诊断和复发监测中的价值。方法:回顾性分析2018年01月至2021年12月在该院确诊并行根治性手术的CRC患者130例，再选择同时间段非CRC患者132例作为对照组，其中腺瘤组72例，健康对照组60例。探究血浆mSEPT9检测在CRC诊断中的作用，并分析mSEPT9在CRC患者术后复发监测中的意义。结果:健康对照组和腺瘤组患者血浆mSEPT9、血清CEA检测的阳性率均低于CRC组，差异均有统计学意义(P<0.05);健康对照组和腺瘤组各指标检测阳性率间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。将CRC发生的危险因素单独列出并以评分的形式量化，生成了预测CRC发生概率的列线图。对CRC患者进行术后随访，多因素Logistic回归分析结果显示：TNM分期(Ⅲ、Ⅳ)期、术前mSEPT9阳性是CRC患者术后复发的独立危险因素(P<0.05)。结论:mSEPT9可作为诊断CRC和监测术后复发的分子标志物。

关键词：
CRC
mSEPT9
Septin9基因甲基化
恶性肿瘤
结直肠癌
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结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是目前世界范围中常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着人类健康。根据国际癌症研究署(International Agency for Research on Cancer, IARC)发布的2022年全球最新癌症统计数据，在所有恶性肿瘤中CRC发病率位居第三，死亡率位居第二[1]。目前临床中仍缺乏对CRC早期诊断敏感且特异的肿瘤标志物，尽管CRC治疗方案更加规范化、合理化，但仍有30%～50%的患者在行根治性手术后会发生复发或转移，成为临床中不可避免的难题[2,3]。当前的研究表明Septin9基因在CRC发生、发展过程起重要作用[4,5]。其在CRC患者外周血中呈高表达，而在健康人群或非恶性肿瘤的疾病患者外周血中呈低表达[6,7,8,9]。因此，Septin9基因甲基化(methylated Septin9,mSEPT9)有可能成为CRC筛查、诊断及复发监测的一个标志物[10],但目前关于复发方面的报道较少。此外，癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)虽然为CRC诊疗规范指南推荐的血液标志物，但其单独作为CRC的诊断和筛查指标存在灵敏度欠佳的问题。因此，本研究拟通过分析CRC患者的血浆mSEPT9的表达探究它在CRC诊断方面的作用以及在CRC术后复发中监测作用，为血浆mSEPT9成为CRC诊断及监测复发的标志物提供可靠的临床依据。

1、资料与方法

1.1 研究对象及病例入组标准

搜集2018年01月至2021年12月间于我院收治入组且符合以下标准的CRC患者，共纳入130例：(1)既往未接受过任何抗肿瘤治疗；(2)首次就诊接受根治性手术治疗；(3)病理诊断证实为腺癌。收集同期132例我院体检中心非肿瘤患者的血液标本作为对照。病例剔除标准：(1)合并其他恶性肿瘤；(2)存在血液系统等全身系统性疾病，影响血液学指标收集；(3)与研究相关的关键临床病历资料缺失。本研究已通过我院伦理委员会的批准(伦理号：KYLX2022082),所有研究对象已知情并签署知情同意书。

1.2 血清CEA和血浆mSEPT9的检测

采集入组人员清晨空腹静脉血10 mL,离心提取血清，由我院检验科采用罗氏E801全自动电化学发光仪及配套的试剂盒按照说明书操作进行血清CEA测定。结果判定：CEA>5 ng/mL判定为阳性，否则为阴性。

mSEPT9检测由我院分子诊断中心完成，用mSEPT9检测试剂盒[博尔诚(北京)科技有限公司] 及罗氏CObasZ480实时荧光定量PCR仪进行Bis-DNA测定，具体步骤如下：(1)提取血浆DNA。(2)亚硫酸盐转化。(3)进行SLAN-96S PCR仪上机。(4)对检测结果进行判读：当检测样本ACTB的Ct值≤32.1,Septin9的Ct值≤41.0时，检测结果判为阳性；当样本ACTB的Ct值≤32.1,Septin9的Ct值>41.0或无法检出(Ct值无显示)时，检测结果判为阴性；若样本ACTB的Ct值大于32.1,则提示检测结果无效。

1.3 统计学方法

统计分析由SPSS 26.0及R 4.1.2完成，统计图由GraphPad Prism 9.0及R Studio绘制。用受试者工作特征(receiver operator characteristic, ROC)曲线和曲线下面积(area under the cure, AUC)比较两种检测方法对疾病的鉴别能力，构建列线图采用Bootstrap自抽样法内部验证，C-index值检验列线图的区分度，利用图形校准法检验评估列线图的校准度；频数资料采用n表示，并用χ2检验或Fisher确切概率法；采用二元Logistic回归分析分析影响CRC患者预后不良的危险因素。所有假设检验比较均为双侧，P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 各组受试人群血浆mSEPT9、血清CEA表达情况分析

健康对照组、腺瘤组、CRC组患者血浆 mSEPT9、血清 CEA 检测的阳性率比较，差异均有统计学意义(P<0.001)。健康对照组和腺瘤组血浆mSEPT9、血清CEA检测的阳性率均低于CRC组，差异均有统计学意义(P<0.05);健康对照组和腺瘤组各指标检测阳性率间比较，差异无统计学意义 (P>0.05),见表1。

表1 各组受试人群血浆mSEPT9、血清CEA表达情况n(%)

2.2 CRC诊断临床预测模型的建立

2.2.1 单因素及多因素分析

将CRC患者及非CRC人群均可获得的一般资料进行单因素分析，结果显示：mSEPT9阳性率、年龄、CEA水平在CRC组与非CRC组差异有统计学意义(P<0.05), 见表2。

单因素分析的结果有意义的指标纳入多因素Logistic回归分析模型，结果显示：mSEPT9、年龄、CEA与CRC密切相关(P<0.05),见表3。

表2 CRC组与非CRC组一般资料比较

表3 CRC诊断的多因素分析

2.2.2 构建列线图

将上述二元Logistic回归分析选出的各独立危险因素单独列出并以评分的形式量化，即mSEPT9阳性计为82分，血清CEA>5 ng/mL计为100分，年龄>60岁计为60分，再将所有独立危险因素的累计得分与结果量表相匹配，生成预测CRC发生概率的列线图(图1)。

图1 CRC的诊断列线图

2.2.3 列线图的评价和验证

列线图采用Bootstrap自抽样法进行数据集内部验证，结果表明，列线图的C-index值为0.9,使用图形校准法评估列线图的校准度。列线图的校准曲线见图2。

2.3 mSEPT9在CRC术后复发转移监测中的作用

对130例CRC根治术后患者进行随访，截至随访日期2022年12月31日，随访过程中25例患者出现术后复发转移，复发转移率为19.23%;在复发转移组与未复发转移组患者中TNM 分期、mSEPT9、CEA、分化程度差异有统计学意义(P<0.05);而性别、年龄、肿瘤部位、BMI差异无统计学意义。将单因素分析中P<0.05,差异有统计学意义的指标纳入Logistic多因素回归分析模型，结果显示：TNM分期、术前mSEPT9阳性为CRC患者术后复发的危险因素(P<0.05),见表4-5。

图2 CRC诊断预测模型校准曲线

表4 CRC术后复发的单因素分析n(%)

表5 CRC术后复发的多因素分析

联合mSEPT9与TNM分期将患者分为四组： A组(Ⅰ、Ⅱ期，mSEPT9阴性)、B组(Ⅰ、Ⅱ期，mSEPT9阳性)、C组(Ⅲ、Ⅳ期，mSEPT9阴性)、D组(Ⅲ、Ⅳ期，mSEPT9阳性)。A组患者术后复发率为3.0%,B组患者术后复发率为5.6%,C组患者术后复发率为6.9%,D组患者术后复发率为42.0%,四组数据总体存在着统计差异(χ2=25.24, P<0.001),D组与A、B、C组相比均存在着统计学差异(P<0.05),A组与B组、A组与C组、B组与C组差异无统计学意义(P>0.05),见表6。

表6 A-D组术后复发率两两比较n(%)

3、讨论

目前研究认为mSEPT9与CRC发生发展密切相关，可作为早期CRC筛查的一种有效方法[11,12,13,14,15],但诊断的准确性可能取决于不同的种族、不同年龄等多种因素[16]。联合诊断对于CRC的早期诊断效果明显优于传统单一检测[17,18]。

本研究进一步将非CRC人群分为对照组和腺瘤组，结果显示血浆mSEPT9阳性率组间无明显差异，提示该检测不能有效鉴别出腺瘤患者。 CHURCH等[19]进行的研究显示，血浆mSEPT9对癌前病变(晚期腺瘤)的检测灵敏度仅有11%。考虑原因是DNA甲基化标志物向血液中释放存在差异所致，而CRC发展过程中发生血管侵袭较晚。这提示mSEPT9可能在癌前病变检测中的价值有限。

本研究创新性的建立mSEPT9、CEA、年龄的临床预测模型，运用列线图将筛选出的各独立危险因素以评分的形式量化直观展示健康人群患CRC的风险。列线图采用Bootstrap自抽样法进行数据集内部验证，列线图的C-index值为0.9,C-index值较为接近于1,说明列线图具有优秀的区分度。模型偏差校正曲线均与理想模型曲线较为贴近，表明列线图的预测结果与实际结果基本吻合。临床医生或患者可以通过简单定位mSEPT9、年龄和CEA检测总评分的相应概率来计算患CRC的概率。

DNA甲基化是肿瘤发生发展过程的早期事件，DNA甲基化状态的改变与肿瘤的发生密切相关[20,21,22,23]。近年来的研究认为Septin9基因发挥了类似抑癌基因的作用[24,25]。通过抑制该基因的正常表达，导致其肿瘤抑制功能丧失，在CRC发生发展中，其基因5' 端的调控区域含有CpG岛容易被甲基化，使DNA分子自身构象发生改变，并且招募CPG结合域蛋白使基因表达受到抑制[26,27,28]。在肿瘤组织中特异度改变的DNA释放到血浆中并构成循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA),可用于监测肿瘤负荷[29]。有研究认为术前mSEPT9状态与CRC患者生存相关[30,31]。本研究对130例CRC患者进行术后随访，结果证明了mSEPT9阳性表达、TNM分期(Ⅲ、Ⅳ期)是CRC术后复发的独立危险因素。我们将TNM分期及mSEPT9结果相结合，分为四组：A组(Ⅰ、Ⅱ期，mSEPT9阴性)、B组(Ⅰ、Ⅱ期，mSEPT9阳性)、C组(Ⅲ、Ⅳ期， mSEPT9阴性)、 D组(Ⅲ、Ⅳ期，mSEPT9阳性),D组患者术后复发率(42.0%) 显著高于A、B、C组 (3.0%、5.6%、6.9%),差异有统计学意义(P<0.05),TNM分期是判断CRC术后预后最重要的工具，提示我们可以将mSEPT9与TNM分期结合，分为不同亚组，对预后进行个体化监测。

然而，我们的研究有一些局限性，仅对构建的诊断预测模型进行了内部验证，因此本研究的结果后续需要基于更大的人群和多中心的数据进行模型外部验证，进一步明确模型的预测能力。

综上所述，我们的研究证实血浆mSEPT9检测可成为CRC筛查的手段之一，提示我们可通过mSEPT9检测利用临床预测模型，简单无创且高效的将CRC高危人群筛查出来，进一步做结肠镜、增强CT、高分辨率MRI等检查，避免过度检查，提高早癌筛查人群依从性，节省医疗资源。提高CRC早癌筛查诊断效能；在肿瘤复发监测中， mSEPT9与预后密切相关，未来或许可以作为TNM分期预测预后的辅助分子分期工具，值得密切关注。

基金资助:云南省科技厅基础研究计划(编号:202101AY070001-177);

文章来源:陈娇娇,李蓉,张可,等.mSEPT9检测在结直肠癌诊断和复发监测中的价值[J].现代肿瘤医学,2024,32(15):2783-2788.