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分析人免疫球蛋白类制品中IgA残留量的ELISA检测方法并应用

2020-06-18 750 上传者：管理员

摘要：目的验证人免疫球蛋白类制品中IgA残留量的ELISA检测方法，并进行应用。方法用IgA国际标准品建立与ELISA检测试剂盒相匹配的标准曲线，并验证方法的准确性、专属性、精密度及线性范围。分别采用ELISA法、紫外法和免疫比浊法检测4批静注人免疫球蛋白（pH4）成品。同时用经验证的ELISA法检测35批静注人免疫球蛋白（pH4）成品中的IgA含量。结果加入0.5、1、2IU/L标准品的样品平均回收率分别为90.33%、94.43%、93.37%,CV分别为4.5%、1.8%、3.1%；标准品加入100、50、25mg/L麦芽糖的回收率分别为99.44%、99.38%、99.67%,CV分别为0.16%、0.13%、0.11%；两个时间点6次重复测定结果的CV均<10%，且两个时间点的测定结果差异无统计学意义（P>0.05）;IgA浓度在0.58IU/L范围内与A450呈良好的线性关系，回归方程为y=0.0887x2-0.1115x+0.188,R2=0.9999。与紫外法和免疫比浊法比较，ELISA法检测结果偏低，紫外法最高，3种方法间差异有统计学意义（P<0.05）。35批静注人免疫球蛋白（pH4）成品中IgA含量均值为（22.4±2.24）IU/mL,CV<10%。结论ELISA检测方法具有良好的准确性、专属性及精密度，且快速、灵敏，操作简便，可用于人免疫球蛋白类制品中IgA含量的质量监测。

关键词：
IgA
人免疫球蛋白
免疫缺陷性病
检测方法
残留量
酶联免疫法
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选择性IgA缺乏症（SIgAD)1968年由VYAS等[1]首次报道，是临床常见的一类免疫缺陷性病。当SIgAD患者输入含有IgA抗原的免疫球蛋白、全血、悬液红细胞、血浆等血液制品后就会出现严重的过敏反应，该反应可涉及心血管、呼吸、消化等多个系统，严重者可发生休克甚至死亡，危及生命[2,3]。因此，严格控制人免疫球蛋白类生物制品药物中IgA的含量具有重要临床意义。

根据《中国药典》三部（2015版）拟新增修订内容的征稿版规定，人免疫球蛋白制品中IgA残留量测定包括紫外分光光度法、ELISA法和免疫比浊法，首次采用ELISA法检测供试品IgA残留量时需进行验证。目前，人免疫球蛋白类制品中生产量最大、应用最广泛的是静注人免疫球蛋白（pH4），因此本研究以其为研究对象，对用于人免疫球蛋白制品中IgA残留量检测的ELISA法进行验证。

1、材料与方法

1.1供试品

静注人免疫球蛋白（pH4）原液和成品均由国药集团武汉血液制品有限责任公司提供。

1.2主要试剂

IgAELISA定量检测试剂盒（批号：314873、315630、316809）购自美国ZeptoMetrixCorporation公司；麦芽糖辅料购自日本食品化工株氏会社；IgA国际标准品（批号：67/086，规格：100IU/支，1IU=14.2μg）购自NIBSC。

1.3标准曲线的建立

取IgA国际标准品1支，用2mL注射用水复溶至浓度为50IU/mL，再用IgAELISA定量检测试剂盒中的稀释液分别稀释为8×10-3、4×10-3、2×10-3、1×10-3、0.5×10-3IU/mL浓度的溶液，按试剂盒说明书进行测定；同时与试剂盒中的标准品曲线进行对比。以标准品溶液IgA浓度的对数对其相应的吸收度作二阶函数分析，获得回归方程。

1.4方法的验证

1.4.1准确度

采用加标回收法。取静注人免疫球蛋白（pH4）原液，用试剂盒的稀释液分别稀释至效价约为1、2、4IU/L（经重复性检测）；另取用注射用水复溶的IgA国际标准品（50IU/mL），注射用水稀释为1、2、4IU/L。将两者按1∶1的体积比进行混合，采用IgAELISA定量检测试剂盒进行检测，重复检测3次，计算同一浓度样品测定结果的变异系数（CV），并按下式计算回收率。

1.4.2专属性

取1批麦芽糖辅料，用纯化水配制成100g/L浓度的溶液，经试剂盒稀释液进行1000、2000和4000倍稀释，即浓度为100、50、25mg/L，分别按1∶1的体积比加入2IU/L的国际标准品，采用IgAELISA定量检测试剂盒进行检测，重复检测3次，计算同一浓度样品测定结果的CV值，并按下式计算回收率。

1.4.3精密度

取静注人免疫球蛋白（pH4）成品，用试剂盒稀释液进行1∶10000稀释，分别于两个不同时间进行测定，每次测定重复6次，计算CV值，并比较两个时间点的检测数据。

1.4.4线性范围

根据建立的标准曲线浓度，用不同批次的IgAELISA定量检测试剂盒（批号为314873及315630）分别测定IgA国际标准品，以IgA国际标准品浓度对数为横坐标，两次检测的A450平均值为纵坐标建立标准曲线，获得回归方程，标准曲线R2应≥0.99。

1.5检测方法的比对

采用IgAELISA定量检测试剂盒及《中国药典》三部（2015版）[4]中的免疫比浊法、紫外法分别检测4批静注人免疫球蛋白（pH4）成品，并对检测结果进行比较。

1.6方法的初步应用

根据标准曲线的设定，采用IgAELISA定量检测试剂盒检测35批静注人免疫球蛋白（pH4）成品。

1.7统计学分析

应用SPSS软件17.0进行统计学分析，组间比较采用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1标准曲线

通过比对，设定的国际标准品的标准曲线范围与试剂盒标准品匹配，其线性结果比试剂盒标准品更好，见图1。表明国际标准品可用于该试剂盒的验证。

2.2方法的验证

2.2.1准确度

加入0.5、1、2IU/L标准品的样品平均回收率分别为90.33%、94.43%、93.37%,CV分别为4.5%、1.8%、3.1%，见表1。

图1国际标准品（A）及试剂盒标准品（B）的标准曲线

2.2.2专属性

标准品加入100、50、25mg/L麦芽糖的回收率分别为99.44%、99.38%、99.67%,CV分别为0.16%、0.13%、0.11%，见表2。表明麦芽糖辅料对IgA检测干扰较小。

2.2.3精密度

两个时间点6次重复测定结果的CV均<10%，且两个时间点的测定结果差异无统计学意义（t=0.35,P>0.05），见表3。表明该方法具有良好的精密度。

2.2.4线性范围

IgA浓度在0.5～8IU/L范围内与A450呈良好的线性关系，两次检测获得标准曲线的R2>0.99，见表4。以均值获得的回归方程为y=0.0887x2-0.1115x+0.188。

2.3检测方法的比对

IgAELISA定量检测试剂盒的检测结果最低，其次为紫外法，免疫比浊法最高，3种方法检测结果差异有统计学意义（t分别为-3.659、-3.621、-27.357,P<0.05），见表5。

表1回收率试验结果

表2专属性验证结果

表3精密度验证结果

表4线性范围检测结果

表53种方法的检测结果

2.4方法的初步应用

35批静注人免疫球蛋白（pH4）样品中IgA含量分别为21.22、24.49、23.64、21.80、23.25、22.58、21.49、19.51、21.63、24.34、24.05、21.14、22.20、26.18、23.88、21.99、23.04、20.20、19.58、19.14、20.25、18.80、23.38、20.23、25.35、24.00、25.01、21.91、21.33、17.05、23.27、27.70、23.24、22.97及24.19IU/mL，均值为（22.4±2.24)IU/mL,CV<10%。

3、讨论

有研究表明，目前检测IgA和抗IgA抗体含量常用的检测方法有免疫比浊法、ELISA法、琼脂单向免疫扩散法、荧光酶免疫分析（FEIA）、被动凝集抑制试验（PHIA）、放射免疫扩散法（RID）及粒胶凝集免疫测定（PaGIA)[3,5,6]等。其中ELISA法由于其简便、快速、灵敏等优点被广泛应用。因此本研究基于《中国药典》三部（2015版）[4]血液制品新增检测项目的要求，选择ELISA法进行检测，并验证该检测方法的线性范围、准确度、专属性、精密性等，结果显示，通过用国际标准匹配ELISA检测试剂盒，建立了与试剂盒完全匹配且准确度在中高低浓度范围内均能达90%以上的标准曲线；通过用不同批号试剂盒对建立的标准曲线进行线性的重复性确定，其R2≥0.99；辅料干扰回收率均达99%以上，精密度的CV均<10%，且不同时间测定同一批样品结果差异无统计学意义（P>0.05）。

对比试验结果显示，ELISA法、紫外法，免疫比浊法3种检测方法差异无统计学意义（P>0.05),ELISA法检测结果偏低，紫外法检测结果最高，可能是由于检测样本较少及其他一些不确定因素，今后需进一步深入研究。

采用ELISA试剂盒检测同一企业的35批静注人免疫球蛋白（pH4）成品中IgA的含量，约为22IU/mL，即约312μg/mL,CV≤10%，表明该企业的生产工艺比较稳定。有研究表明，丙种球蛋白治疗中的副作用可能与其在制备过程中含有微量IgA引起的IgA和抗IgA抗体之间的反应有关[7,8,9,10]。目前国内外对IgA缺乏症者发生过敏性输血反应的机制尚未明确[11,12]，在临床输血工作中不仅要检测患者血清IgA的含量，还要对IgA缺乏型输血过敏反应机制进行进一步探讨，做好预防工作。

参考文献：

[2]张松铭.受血者输血前检测IgA含量的临床意义[J].当代医学,2014,20(5):111.

[3]王明明.IgA含量与输血超敏反应相关性检测分析[J].世界最新医学信息文摘,2015,15(25):31.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典(三部)[S].北京:中国医药出版社,2015:通则3428

[7]段徐华,尹红锐,吴利红,等.应用酶联免疫法测定人免疫球蛋白类制品中IgA含量[J].药物分析杂志,2018,38(2):307-312.

[11]陈扬,崔颖,杨世明,等.IgA缺乏型输血过敏反应研究进展[J].细胞与分子免疫学杂志,2017,33(3):428-430.

邹浩勇,喻剑虹,龚钦,彭焱.人免疫球蛋白类制品中IgA残留量ELISA检测方法的验证及应用[J].中国生物制品学杂志,2020,33(06):695-698.