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FCM分析血液淋巴细胞免疫表型方法学因素对实验结果的影响

2021-03-12 183 上传者：管理员

摘要：目的探讨流式细胞术(FCM)分析血液淋巴细胞免疫表型方法学因素对实验结果的影响。方法以FCM分析血液淋巴细胞免疫表型，分析不同时间测定淋巴细胞、单核细胞与中性粒细胞表面白细胞共同抗原含量，不同设门方法测定淋巴细胞百分比，不同染色方法分析淋巴细胞免疫表型差异，找出影响实验结果的相关因素。结果血液标本放置1h、6h、8h后淋巴细胞白细胞共同抗原含量对比，差异无统计学意义(P>0.05)；血液标本放置1h、6h、8h后单核细胞、中性粒细胞白细胞共同抗原含量对比，差异显著(P<0.05)；散射光设门、荧光/散射光设门、三色荧光/侧向角散射光测定的GL、TL对比，差异显著(P<0.05)；单色、双色、三色法分析T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞及T+B+NK细胞对比，差异显著(P<0.05)。结论FCM分析血液淋巴细胞免疫表型实验结果受标本放置时间、淋巴细胞设门方法与染色方法影响，临床需选取最佳检测时间、淋巴细胞设门方法与染色方法，以提高分析结果准确性。

关键词：
临床评估
实验结果影响
流式细胞术
结果准确性
血液淋巴细胞免疫表型
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流式细胞术(FCM)是目前临床分析血液淋巴细胞免疫表型首选方法，其灵敏度高、分析速度快，可为临床评估各类疾病的发生与发展提供重要依据[1,2]。但经临床研究发现，其实验结果受多种因素影响，进而难以确保实验结果准确性，因此临床需积极找出其影响因素，以确保实验结果[3,4]。但现阶段相关影响FCM分析淋巴细胞免疫表型实验结果的相关因素报道较少，鉴于此，本研究旨在探讨FCM分析血液淋巴细胞免疫表型实验结果的影响因素。具体如下。

1、材料与方法

1.1检测仪器与试剂

流式细胞仪选自美国BD公司生产的FACSort型；流式细胞仪校准微球：双色微球、三色微球；免疫表型防分析质控细胞：CD-Chex；荧光素标记单克隆抗体：McAb，其中单色标记McAb涵盖CD3、CD4、CD8、CD16、CD19、CD45、CD56、鼠lgG1、鼠lgG2a；双色标记McAb涵盖CD3/CD4、CD3/CD8、CD3/CD19、CD3/CD16+56、鼠lgG1/lgG2a；三色标记McAb涵盖CD3/CD4/CD45、CD3/CD8/CD45、CD3/CD19/CD45、CD3/CD16+56/CD45、CD4/CD8/CD43、lgG1/lgG2a/CD45；红细胞溶解剂：FACS，检测试剂均选自美国BD公司。

1.2方法

采集15名正常人血液标本，进行免疫荧光染色与溶血后，对其进行洗涤与固定，并调节流式细胞仪相关参数，参照美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的相应方法以FCM分析经荧光标记的样本；于室温20～22℃环境下，分别在标本放置后1h、6h、8h测定其淋巴细胞、单核细胞与中性粒细胞表面的白细胞共同抗原含量，其含量应用叶绿素蛋白的平均吸光度(MFI)反映，并于同一时间以散射光设门、荧光/散射光设门、三色荧光/侧向角散射光设门三种方法评估门内淋巴细胞的百分比(GL)、门内淋巴细胞占标本总淋巴细胞的百分比(TL)含量，同时分别应用单色、双色、三色免疫荧光法对血液标本进行染色，淋巴细胞设门方法分别应用散射光设门、荧光/散射光设门、三色荧光/侧向角散射光三种，分析淋巴细胞免疫表型。

1.3观察指标

探讨不同时间测定淋巴细胞、单核细胞与中性粒细胞表面白细胞共同抗原含量，不同设门方法测定淋巴细胞百分比，不同染色方法分析淋巴细胞免疫表型差异，明确影响实验结果的相关因素。

1.4统计学方法

数据采用SPSS18.0软件处理，以表示计量资料，用独立样本t检验组间数据，三组间比较采用单因素方差分析检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1不同时间测定白细胞共同抗原含量对比

血液标本放置1h、6h、8h后淋巴细胞白细胞共同抗原含量对比，差异无统计学意义(P>0.05)；血液标本放置1h、6h、8h后单核细胞、中性粒细胞白细胞共同抗原含量对比，差异显著(P<0.05)。见表1。

表1不同时间测定白细胞共同抗原含量对比

2.2不同设门方法测定淋巴细胞百分比对比

散射光设门、荧光/散射光设门、三色荧光/侧向角散射光测定的GL%、TL%对比，差异显著(P<0.05)。见表2。

2.3不同染色方法分析淋巴细胞免疫表型对比

单色、双色、三色法分析T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞及T+B+NK细胞对比，差异显著(P<0.05)。见表3。

表2不同设门方法测定淋巴细胞百分比含量对比

表3不同染色方法分析淋巴细胞免疫表型对比

3、讨论

目前临床诊断肿瘤、自身免疫性疾病、血液病等多采用FCM分析血液内淋巴细胞表型，其具有灵敏度高、速度高、可多参数分析等优势，对各类疾病的诊断具有较高诊断价值。但经临床实践发现，FCM分析过程中存在诸多影响因素，易导致实验结果出现偏差，影响临床诊断[5]。

本研究结果显示，血液标本不同放置时间单核细胞、中性粒细胞白细胞共同抗原含量、不同设门方法测定淋巴细胞百分比含量及不同染色方法分析淋巴细胞免疫表型对比均存在差异，表明标本放置时间、设门方法及染色方法均对实验结果有影响。分析原因在于，白细胞共同抗原表达存在时间依赖性，故其标本放置时间对实验结果有影响，且有研究显示其对淋巴细胞门设定也存在一定影响，因此临床取血后需进行快速检测，保障实验结果准确性[6]。以FCM分析淋巴细胞表型时，临床除需设置淋巴细胞门，确保准确分析淋巴细胞，而淋巴细胞门中，GL、TL是影响免疫表型结果的主要细胞，因此分析出两者含量对保障分析结果至关重要，而本研究发现三色荧光/侧向角散射光对GL、TL检出率最高，散射光设门检出率最低，但其检测结果与荧光/散射光设门结果对比无差异。而有研究显示，荧光/散射光设门虽避免淋巴细胞门设置的主观误差，但其本质仍为散射光设门，故易受不溶血红细胞及有核细胞干扰，因此三色荧光/侧向角散射光应用效果最佳[7,8]。

于淋巴细胞免疫表型分析中，单色分析易将非T-CD4+、非T-CD8+细胞计入，故其误差较大，而双色分析结果虽接近于三色分析，但三色分析结果更加准确，因此三色分析应为临床首选方法[9]。此外有研究显示，应用四色免疫荧光染色应用价值高于三色染色，但其对检测仪器配置、调制与校准要求更高，故临床需结合实际情况选择染色方法[10]。

综上所述，FCM分析血液淋巴细胞免疫表型实验结果受标本放置时间、淋巴细胞设门方法与染色方法影响，临床需选取最佳检测时间、淋巴细胞设门方法与染色方法，以提高分析结果准确性。

参考文献：

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