胶质瘤是成人中枢神经系统最常见的原发恶性肿瘤[1],占所有中枢神经系统肿瘤的80%[2]。WHO分级为4级的胶质母细胞瘤(glioblastoma, GBM)预后最差。虽然高级别胶质瘤术后应用替莫唑胺(TMZ)化疗方案在一定程度上延长了患者的生存时间[3],但部分患者的预后仍较差[4]。这可能是由于胶质瘤手术方法的局限性，无法将病变与正常脑组织完全分离，以及由于血脑屏障的存在和肿瘤细胞的快速增殖而导致的肿瘤血管不足[5],药物很难通过血液循环到达肿瘤，并达到足够的浓度来实现局部功能。此外，GBM细胞表现出极强的侵袭性[6]和异质性[7]。因此，单一药物化疗可使胶质瘤细胞产生抗药性，使其异质性进一步复杂化，并导致胶质瘤复发[8]。

铁死亡从根本上不同于细胞凋亡、焦亡、自噬和其他细胞死亡方法，在形态、生化或遗传学方面没有相似之处[9]。铁死亡的特征是氧化还原活性铁[10]的有效性，磷脂氢过氧化物酶GPX4[11]失去脂质过氧化修复能力，以及含有多不饱和脂肪酸(PUFA)的磷脂[12]被氧化。铁死亡是通过半胱氨酸(Cys)耗尽或谷胱甘肽过氧化物酶4(Gpx4)的抑制在肿瘤细胞中被触发的[13]。亚细胞结构变化表现为肿瘤细胞内线粒体脊的减少或消失以及线粒体膜内外膜的破坏[14]。IVANOV等人[15]用含铁水的饲料长期喂养胶质瘤移植大鼠，发现其促进了大鼠胶质瘤的生长，并改善了放射治疗的效果，这种作用在注射去铁胺后消失。另一项研究[16]表明，铁和铁代谢可能会影响胶质瘤患者的预后。ALIM[17]发现，硒可以抑制神经细胞中GPX4依赖的铁死亡。GPX4的消耗导致体内和体外的神经变性[18]。我们的研究将重点放在铁死亡的关键调节因素上，并探索PL诱发胶质瘤细胞铁死亡的机制。

荜茇酰胺(piperlongumine, PL)作为中药荜茇的重要有效成分之一，被证实可透过血脑屏障[19]。PL的抗肿瘤作用受到越来越多的关注，有研究显示PL诱导胃癌细胞[20]及胰腺癌细胞[21]发生铁死亡。PL还能显著杀伤胶质瘤细胞[22]。一项PL对胶质瘤细胞增殖影响的研究显示PL能降低肿瘤细胞增殖能力[23]。但目前尚缺乏PL导致胶质瘤细胞铁死亡的相关研究。

1、材料和方法

1.1细胞系和细胞培养试剂

人脑胶质瘤LN229和A172细胞系(American Type Culture Collection),前者使用含5%胎牛血清(Fetal Bovine Serum, Biological Industries)的高糖DMEM培养基(BasalMedia上海源培生物科技有限公司),后者使用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，培养基中均添加1%青链霉素，两种细胞在含有5%CO2的37℃恒温培养箱中培养。

1.2主要试剂和抗体

荜茇酰胺(Piperlongumine)购自Selleck公司，溶于DMSO,储存在-80℃冰箱中。铁死亡抑制剂Ferrostatain-1(Selleck,使用浓度4μmol/L),Liproxstatin-1(Selleck,使用浓度0.1μmol/L),坏死抑制剂Necrostatin-1(Selleck,使用浓度10μmol/L),凋亡抑制剂Z-VAD-FMK(Selleck,使用浓度25μmol/L),自噬抑制剂Mdivi-1(Selleck,使用浓度20μmol/L)和Chloroquine(Selleck,使用浓度10μmol/L),以上抑制剂均储存在-20℃冰箱中。抗体α-Tubulin (Abcam, WB 1∶1 000);PTGS2(Abcam, WB 1∶600);EZH2(Abcam, WB 1∶1 000;IHC-P 1∶100);Keap1(Abcam, WB 1∶500);Nrf2(Abcam, WB 1∶1 000,IHC-P 1∶100);GPX4(Abcam, WB 1∶1 000,IHC-P 1∶100);xCT(Cell Signaling Technology, WB 1∶1 000 dilution);H3K27me3(Abcam, WB 1∶1 000;CHIP 1∶50);GAPDH(华安生物，WB 1∶10 000);4-HNE(Santa, IF 1∶100);Ki67(Abcam, IF 1∶100,IHC-P 1∶200);Rabbit IgG (Invitrogen, WB 1∶10 000)。

1.3方法

1.3.1细胞活力检测

(1)使用96孔板培养细胞，每孔3 000个细胞，加入不同浓度PL,每个浓度梯度有6个复孔。分别于加药后24 h, 48 h, 72 h, 96 h,加入CCK-8试剂(MedChemExpress),利用酶标仪测量每孔细胞在450 nm处的吸光度，使用Prism软件分析数据及作图，采用非线性回归拟合法计算IC50。(2)加入各种死亡抑制剂：Ferrostatain-1,Liproxstatin-1,Necrostatin-1, Z-VAD-FMK, Mdivi-1和Chloroquine, 1小时后加入PL(10μmol/L),48小时后检测细胞活力。

1.3.2克隆形成实验

使用6孔板培养细胞，每孔细胞1 000个。细胞培养箱中培养5天左右加入PL(10μmol/L,15μmol/L)处理，继续培养5天左右，在细胞生长到肉眼可见集落时候取出，用化学发光凝胶显像仪(Bio-Rad)拍照，使用Image J统计集落数量。

1.3.3透射电子显微镜下观察

用10μmol/L PL处理细胞48小时后，消化离心细胞，用固定液固定细胞，在电子显微镜(OLYMPUS)下观察亚细胞结构。

1.3.4 GSH、MDA水平测定

使用GSH试剂盒(Beyotime),Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit(Sigma-Aldrich)测定GSH、MDA水平，具体操作方法遵照试剂盒说明书进行。

1.3.5免疫荧光

将细胞铺于12孔板中，细胞密度为50%,分别用10μmol/L和15μmol/L的PL处理细胞，24小时后孵育一抗、二抗及DAPI(Beyotime, 1∶1 000),在倒置荧光显微镜下(Leica)观察，拍照。

1.3.6流式细胞术(Flow cytometry)检测细胞凋亡率和细胞内ROS水平

将细胞接种于6孔板中，分别用PL(10μmol/L)和PL(10μmol/L)+Fer-1(4μmol/L)处理48小时，使用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒(Beyotime),流式细胞仪(BD,美国)进行凋亡检测为检测细胞内ROS含量，分别用PL(10μmol/L)和PL(15μmol/L)处理48小时，使用ROS检测试剂盒中的DCFH-DA(Beyotime, 3μmol/L)探针孵育30 min,进行流式细胞仪检测。

1.3.7生信分析寻找靶基因及分子对接评价

应用Sangerbox绘制韦恩图，对荜茇酰胺药物作用靶点、铁死亡相关基因、GBM差异基因表达最显著的模块三者取交集处理，获得荜茇酰胺促进GBM铁死亡的相关基因。使用Autodock和Pymol软件对荜茇酰胺与其作用于GBM铁死亡相关靶蛋白进行分子对接和可视化处理，依据结合能量的高低评估对接效果。

1.3.8 Western blot

收集细胞，在冰上裂解细胞，4℃、14 000 r/min离心(Eppendorf)后取上清液，提取蛋白，用BCA法蛋白定量试剂盒(Biotake Corporation)在多功能酶标仪(FLUOstar Omega,波长562 nm)上测定蛋白浓度，配平各蛋白样本。用10%的SDS-PAGE电泳分离等量蛋白质，然后转移到NC膜(Bio-Rad)上，室温下用5%脱脂牛奶封闭1 h, 4℃下一抗孵育过夜，室温下二抗孵育1 h。使用ECL发光液(Beyotime)检测蛋白质条带，用化学发光凝胶显像仪(Bio-Rad)成像并拍照，以α-Tubulin作为内参，使用Image J软件对蛋白质表达进行定量分析。

1.3.9 RT-qPCR

用Trizol(Ambion)裂解细胞，提取RNA,加入DEPC(Biosharp)水，测RNA浓度及纯度。冰上配置逆转录反应体系[4x ABScript Neo RT Master Mix(ABclonal),20x gDNA Remove Mix II(ABclonal),Nuclease-Free H2O(ABclonal),RNA样本],逆转为cDNA,-20℃储存。配置PCR反应体系[TB Green PreMix Ex Taq(Takara),cDNA样本，正向引物，反向引物，ddH2O]。GAPDH作为内参，数据采用2-ΔΔCT法进行计算，PCR循环。引物序列：GAPDH正向ACATCGCTCAGACACCATG,GAPDH反向TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG;Nrf2正向TCAGCGACGGAAAGAGTATGA,Nrf2反向CCACTGGTTTCTGACTGGATGT;xCT正向TTTTGTACGAGTCTGGGTGG,xCT反向CGCAAGTTCAGGGATTTCAC;GPX4正向CGCTGTGGAAGTGGATGAAG,GPX4反向TTGTCGATGAGGAACTGTGG; EZH2正向AATCAGAGTACATGCGACTGAGA,EZH2反向GCTGTATCCTTCGCTGTTTCC。

1.3.10质粒转染过表达EZH2基因

将LN229细胞和A172细胞分别分为空白组，EZH2-NC(vector)组；EZH2-OE组；EZH2-NC+PL(10μmol/L)组；EZH2-OE+PL(10μmol/L)组；应用过表达质粒PLV3-CMV-EZH2(human)-3xFLAG-Puro(淼灵，货号P29270)转染24 h后，加PL(10μL);48 h后，提取蛋白，检测蛋白表达情况。

1.3.11 CHIP及qPCR实验

收集固定LN229及A172细胞，分为Vehicle组和PL(10μmol/L,15μmol/L )组，应用PL处理48 h后，超声破碎细胞，加入H3K27me3抗体，与超声后的靶蛋白-DNA复合物相互结合，过夜孵育，加入ProteinA+G Agarose,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀，对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合，洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物，解交联，纯化富集的DNA片段，qPCR分析，引物序列：Keap1正向CTGGAGGATCATACCAAGCAGG,Keap1反向GGATACCCTCAATGGACACCAC。

1.4统计学分析

所有实验均独立重复三次。数据用平均值±标准差表示。绘制图 表及数据统计分析采用GraphPad Prism软件8.0.1,组间比较采用t检验和方差分析。P值小于0.05表示差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 PL抑制胶质瘤细胞增殖

PL化学结构如图1A所示。我们将不同浓度的PL(0μmol/L,2μmol/L,5μmol/L,8μmol/L,11μmol/L,14μmol/L)应用于LN229细胞和A172细胞，分别于24 h, 48 h, 72 h, 96 h,加入CCK-8试剂，应用酶标仪测定450 nm处的吸光度值，结果表明(图1B,C),PL明显抑制胶质瘤细胞活力，其抑制作用具有时间和浓度依赖性，随着PL浓度增高，作用时间的延长，抑制作用增强。PL对LN229和A172细胞作用48 h的IC50值分别为10.19μmol/L和11.82μmol/L。

细胞克隆形成实验(PL 0μmol/L,10μmol/L,15μmol/L)显示随着PL浓度增加，细胞集落形成数量减少，PL对胶质瘤细胞集落形成能力的抑制作用增强(图1D)。

在Ki67染色实验(图1E,F)中，与对照组相比，使用PL处理显著抑制了脑胶质瘤细胞LN229和A172细胞的Ki67阳性染色率，随着PL使用浓度增加，抑制作用增强，表明PL抑制了脑胶质瘤细胞的增殖能力。

2.2 PL诱导胶质瘤细胞发生铁死亡

用流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)的含量(图2A),结果表明PL以剂量依赖的方式增加了胶质瘤细胞内ROS的积聚。

不同浓度PL作用于脑胶质瘤细胞LN229和A172细胞24小时后，应用MDA和GSH试剂盒测定细胞内的过氧化脂质MDA和GSH,免疫荧光实验检测过氧化脂质代谢产物4-HNE。结果显示MDA(图2B)和4-HNE(图2D)的水平显著升高，GSH(图2C)降低，均呈剂量依赖性。

用透射电子显微镜观察线粒体形态变化(图2E)发现，经PL处理24小时后，LN229和A172细胞的线粒体体积减小，膜皱缩，线粒体嵴减少。

上述这些改变均支持细胞发生了铁死亡。

2.3 PL通过诱导铁死亡抑制胶质瘤细胞增殖

用铁死亡抑制剂Fer-1和Lip-1,坏死抑制剂Nec-1,凋亡抑制剂V-ZAD,自噬抑制剂CQ-1以及线粒体自噬抑制剂Mdivi-1处理LN229和A172细胞，用CCK-8试剂测定吸光度值，实验结果显示(图3A),PL可抑制两种脑胶质瘤细胞活力，所有抑制剂都能够回复PL对脑胶质瘤细胞活力的抑制作用，但以铁死亡抑制剂回复明显，其他抑制剂回复作用没有统计学意义。

流式细胞凋亡实验(图3B)显示经PL(10μmol/L)处理48小时后，胶质瘤细胞死亡明显，而加入Fer-1细胞死亡减少，可见铁死亡抑制剂Fer-1可以成功逆转这种死亡。

2.4 PL影响胶质瘤细胞中铁死亡相关蛋白的表达

LN229细胞和A172细胞加药处理48 h后，提取蛋白，WB检测蛋白表达。PL呈浓度依赖性上调胶质瘤细胞中铁死亡标志蛋白PTGS2的表达，下调相关蛋白NRF2、xCT和GPX4的表达(图4A),这些蛋白的差异具有统计学意义(图4B)。

图1 PL抑制胶质瘤细胞增殖

图2 PL诱导胶质瘤细胞铁死亡

2.5生信分析查找荜茇酰胺促进GBM铁死亡相关基因及分子对接评价

通过生信分析，我们对荜茇酰胺药物作用靶点、铁死亡相关基因、GBM差异基因表达最显著的模块三者取交集处理，获得荜茇酰胺促进GBM铁死亡的三个相关基因：MAPK8,EZH2,RGS4(图5A)。

荜茇酰胺小分子配体与靶蛋白大分子MAPK8通过1个氢键结合，连接1个残基(ASP-167),结合能为-3.18 kCal/mol;与靶蛋白大分子RGS4通过1个氢键结合，连接1个残基(ASP-44),结合能为-1.8 kCal/mol。而其与靶蛋白大分子EZH2通过4个氢键结合，连接3个残基(LYS-6835、GLY-648、GLU-645),结合能为-3.83 kCal/mol,小分子位于大分子口袋中，结合最稳定(图5B,C)。

图3 PL通过铁死亡促进细胞死亡

图4 PL影响铁死亡相关蛋白的表达

图5荜茇酰胺促进GBM铁死亡的靶点(韦恩图,A)及PL与EZH2的分子对接评价(B-C)

2.6 PL影响靶蛋白EZH2及其下游蛋白的表达

通过我们的生信分析和分子对接，我们找到了PL作用于GBM的主要靶点，MAPK8和EZH2,WB结果显示经PL处理后，GBM细胞的MAPK8表达无明显变化，而EZH2表达显著减少，众所周知，EZH2催化组蛋白H3的赖氨酸27的三甲基化，而组蛋白与转录抑制有关；另一方面，Keap1-Nrf2系统是已经确定的蛋白酶体降解系统，Keap1促进Nrf2的泛素化，进而被快速降解，Nrf2/xCT/GPX4调节轴又是一条公认的介导铁死亡的途径，因此我们检测了这些蛋白在不同浓度PL处理后的GBM细胞中的表达情况。结果显示，PL在蛋白水平上显著抑制EZH2、H3K27me3和Nrf2的表达。相反，PL明显促进了Keap1(Nrf2的负调控因子)的表达(图6)。

图6 WB检测蛋白表达及蛋白定量分析

2.7 PL促进Keap1转录

RT-qPCR实验检测结果显示(图7),不同浓度的PL作用于LN229和A172细胞后，细胞中EZH2、Nrf2的mRNA水平不变，而Keap1的mRNA水平显著增高。该结果表明，PL可能是通过抑制EZH2/H3K27me3(抑制靶基因表达)活性，从而释放了对Keap1基因(Nrf2的负调控因子)的转录抑制作用，使Keap1的转录增加，进而Keap1蛋白表达水平上调，进而抑制下游靶蛋白分子Nrf2的表达，从而触发铁死亡来抑制胶质瘤细胞的增殖。因此，我们大胆推测，H3K27me3蛋白和Keap1基因之间可能存在相互作用。

2.8 PL介导的EZH2/H3K27me3抑制促进了Keap1的转录

CHIP结果显示(图8),在PL处理的细胞中，用H3K27me3抗体沉淀蛋白-DNA复合物后，通过qPCR检测Keap1 DNA,我们发现与H3K27me3蛋白结合的Keap1 DNA量随着PL浓度的增加而减少，证明H3K27me3蛋白和Keap1 DNA之间确实存在相互作用，验证了H3K27me3对Keap1存在转录调控作用，随着PL使用浓度增加，这种调控作用减弱。

2.9过表达EZH2部分逆转了PL诱导的GBM细胞铁死亡

为进一步确定EZH2在PL诱导的铁死亡中的作用，我们通过质粒转染制造了EZH2过表达的LN229和A172细胞。在PL处理下，H3K27me3和Nrf2的表达下调及Keap1的表达上调被EZH2的强制过表达部分逆转(图9A-B)。进一步的研究表明，过表达EZH2明显减弱了PL诱导的胶质瘤细胞的死亡(图9C-D)。ROS积累增加也被EZH2的过度表达抵消(图9E)。在GSH和MDA表达水平上也观察到类似的结果(图9F)。这些结果表明，EZH2确实参与了PL诱导的铁死亡。

图7 RT-qPCR检测mRNA水平

图8 CHIP实验

3、讨论

胶质母细胞瘤是成人发病率和死亡率最高的颅内原发性肿瘤[24]。目前，国际上最常用的标准治疗方案对改善GBM患者预后的作用有限。

铁死亡是一种新发现的死亡方式，最新研究表明铁死亡在肿瘤的发生和耐药中起着重要作用[25-26]。目前研究发现，药物诱导铁死亡主要通过以下三个途径[27]:(1)抑制胱氨酸/谷氨酸逆转运体(Xc-系统);(2)抑制或消耗GPX4的表达；(3)高表达p53。过去十年进行的研究[28]已经确定了调控细胞铁死亡的核心调控因子，包括Nrf2、SLC7A11(xCT)、GPX4、ATF4、FSP1和p53等。

GPX4是一种硒蛋白，全称磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶4,其具有清除膜脂过氧化氢的能力，含有抗铁死亡所需的关键的硒半胱氨酸残基[29]。GPX4利用谷胱甘肽(GSH)作为辅因子来消除磷脂过氧化，阻止铁(Fe2+)依赖的脂质相关ROS的累积，从而抵抗铁死亡发生[30-31]。抑制GPX4活性会诱导有毒脂质ROS的产生，并在多种肿瘤细胞中引发铁死亡[32]。我们发现PL对GBM细胞的GPX4有抑制作用，并导致ROS积聚，这与先前的研究[33]一致。SLC7A11/xCT是胱氨酸转运蛋白系统Xc-系统(也叫胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白，由轻链亚基xCT/SLC7A11和重链亚基SLC3A2组成)的一个催化亚基，它排出谷氨酸以换取细胞外的胱氨酸，胱氨酸是GSH的合成材料[34]。在本研究中，我们的结果表明，PL抑制了GBM细胞中xCT和GPX4的表达，并降低了GSH水平。这些结果表明，铁死亡参与了PL介导的抗GBM活性。除此之外，我们的研究还发现超微结构显示细胞内线粒体变小，双层膜密度增高，细胞内ROS、MDA、4-HNE积聚，铁死亡特异性抑制剂Fer-1及Lip-1能够逆转这种抑制作用；铁死亡标志蛋白PTGS2水平增高，铁死亡相关蛋白Nrf2水平降低。进一步证明，PL通过铁死亡抑制GBM细胞增殖。

图9 EZH2的强制过表达部分逆转了PL诱导的铁死亡

GPX4和xCT是两个已明确的Nrf2靶点[35],抑制Nrf2显著加速了铁死亡诱导药物的治疗效果，表明Nrf2是铁死亡的关键调节因子[36]。Nrf2是细胞氧化应激反应中的关键转录因子。而Keap1又是Nrf2的主要负调控因子[37],当细胞暴露在氧化应激下时，Nrf2逃脱Keap1的抑制并激活抗氧化反应元件(ARE)依赖的基因表达[38]。Nrf2在GBM细胞中高表达，与预后不良有关[39]。Keap1-Nrf2通路参与了胶质瘤的铁死亡。Keap1-Nrf2信号通路的激活可上调xCT。研究还发现，抑制Keap1和促进Nrf2表达和均可增强胶质瘤细胞对铁死亡的抵抗力。我们的研究结果也表明，增加Nrf2的表达部分逆转了被抑制的xCT和GPX4的表达，进而部分逆转了铁死亡。而Nrf2如何被抑制仍然是个有待思考的问题，众所周知，Keap1(Kelch样ECH关联蛋白1)是Nrf2的主要负调控因子，该蛋白与Nrf2相互作用，并通过介导Nrf2泛素化和降解将其保持在低水平[40]。我们的研究结果表明，PL对Keap1有明显的促进作用。PL是如何促进Keap1表达，我们进行了更深一步的研究。

我们通过生信分析找到了PL的主要作用靶点，通过实验证明了EZH2是PL作用于GBM细胞的有效的铁死亡相关的靶点。Zeste同源基因增强子2(EZH2)是多梳组基因(PcGs)家族中的一员，PcGs是一组重要的抑制转录的表观遗传调控因子。多梳抑制复合体2(PRC2)是PcG蛋白的两个核心复合体之一，主要通过调节染色质结构介导基因沉默[41]。EZH2是PRC2的一个酶催化亚基，可以通过组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化修饰(H3K27me3)[42]来改变基因表达。H3K27me3与基因表达抑制有关，被认为是组织发育和干细胞命运决定过程中的关键表观遗传事件[43]。有研究显示EZH2修饰H3K27me3抑制xCT的表达，进而促进铁死亡的发生，但是其中间复杂的分子机制尚不清楚[44]。另有研究显示促进EZH2介导的转录抑制而抑制SOCS3和Nrf2的表达[45],引起线粒体功能障碍，抑制小胶质细胞的激活。

在我们的研究中，我们首次发现H3K27me3蛋白与Keap1基因存在相互作用，从而证明EZH2修饰H3K27me3抑制Keap1的转录，从而减少了Nrf2泛素化和降解，进一步影响下游靶分子xCT/GPX4,最终调控铁死亡。

综上所述，我们的结果首次显示PL以铁死亡依赖的方式抑制GBM细胞的生长和诱导细胞死亡，从而发挥其抗癌作用。PL抑制EZH2,通过EZH2/H3K27me3/Keap1/Nrf2轴，最终抑制Nrf2表达，进而调控下游靶基因xCT/GPX4的表达[46]。

荜茇酰胺通过一个新的EZH2/H3K27me3/Keap1/Nrf2通路诱导胶质瘤细胞发生铁死亡，发挥其抗胶质瘤作用，有望为GBM的治疗提供一个有潜力的药物。

基金资助:辽宁省沈阳市科技计划项目(编号:20-205-4-003);

文章来源:仇建婷,史记,郭堂军,等.荜茇酰胺诱导胶质瘤细胞铁死亡的机制[J].现代肿瘤医学,2024,32(22):4262-4272.