骨质疏松症(osteoporosis, OP)是一种骨代谢紊乱疾病，骨量减少和骨微结构破坏为其主要特征[1]。绝经后妇女OP发病率约为50%,是最常见的OP类型[2]。绝经后妇女卵巢机能降低和雌激素水平下降，致破骨细胞(osteoclast, OC)骨吸收能力和成骨细胞(osteoblast, OB)的骨形成能力严重不对等，最终造成绝经后妇女骨量减少，骨脆性增大[3],使其更容易发生骨折和其他骨相关疾病。

目前临床治疗OP以骨吸收抑制剂及合成代谢剂药物治疗为主，但疗效与安全性往往不及预期[4],因此，寻找安全有效的治疗方法具有重要的临床意义。中医外治法治疗OP经验丰富，临床疗效显著且无明显副作用，值得深入探讨。

热敏灸是对传统艾灸加以创新改良而形成的一种新疗法，通过艾灸敏化腧穴，利用悬灸过程中产生透热、扩热和传热作用来增强疗效[5]。其可通过降低OC活性，降低骨转换率，进而改善OP[6]。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKT)信号通路是调节骨形成与骨吸收的重要途径[7],作为其下游因子的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)通过调控细胞生长和代谢，影响OC的分化和功能，对OP的发生和发展起着关键作用[8]。研究发现，PI3K/AKT/mTOR通路异常活化可促进机体炎症反应，过度激活自噬及OC生成，从而导致OP等骨相关疾病[9]。基于此，本研究通过构建去势小鼠OP模型，观察热敏灸对OP小鼠的治疗效果，研究热敏灸干预后血清对破骨细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响，为其临床应用提供理论支持。

1、材料与方法

1.1实验材料

1.1.1动物与细胞：

SPF级KM雌性小鼠50只，8周龄，体重(34±2) g,购自江西中医药大学实验动物科技中心，动物合格证号为SCXK(赣)2023-0001。小鼠单核-巨噬细胞系RAW264.7细胞，由自武汉普诺赛生命科技有限公司供应。本实验按照江西中医药大学实验动物伦理委员会的相关规定执行，伦理批准号：JZLLSC20240005。

1.1.2药物与试剂：

戊酸雌二醇(拜耳医药保健有限公司广州分公司，国药准字J20171038);热敏灸艾条(规格4 mm×120 mm,由江西省中医院自制);吸入用七氟烷(鲁南贝特制药有限公司，国药准字H20080681);RANKL(MCE,HY-P7425A);完全DMEM培养基、不完全DMEM培养基(凯基生物，KGM12800S、KGM12800N);TRAP染色试剂盒(Servicebio,批号G1050-50T);RNA提取试剂盒(CWBIO,CW0581M);RNA逆转录试剂盒(Vazyme, R223-01);p-PI3K(Affinity, af3242);p-AKT(Bioss, bs-0876R);p-mTOR(Bioss, bs-3495R)。

1.1.3主要实验仪器：

红外电子体温计(华盛昌CEM,DT-806L);双能X线骨密度仪(Hologic, Discovery Wi);电泳仪(北京六一生物科技有限公司，DYY-8C);荧光PCR仪(上海伯乐生命医学产品有限公司，CFX ConnectTM实时);全自动酶标仪(上海闪普，SuPerMax 3100);高速台式冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，H1750R);CO2培养箱(上海一恒科学仪器有限公司，BPN-80CW);倒置荧光显微镜(广州市明美光电有限公司，MF53);超高灵敏度化学发光成像系统仪(上海伯乐生命医学产品有限公司，Chemi DocTM XRS+)。

1.2实验方法

1.2.1模型构建：

经适应性喂养1周后，随机选取8只小鼠为假手术组，其余小鼠为造模组。造模组的小鼠接受双侧卵巢切除术以建立绝经后OP模型[10-11],而假手术组小鼠仅切除卵巢周围的等体积脂肪。术后3 d常规伤口消毒、抗感染，1周后对其进行干预。造模过程死亡5只小鼠，死亡原因均为腹腔出血及胃肠胀气、肠梗阻，实际纳入45只小鼠进行后续实验。

1.2.2动物分组及干预：

将造模后的小鼠随机分为模型组(8只)、雌激素组(8只)、艾灸组(21只)。艾灸组悬灸“肾俞”,具体位于第2腰椎下两旁，背正中线旁开3 mm(穴位定位参考由中国针灸学会发布的《实验动物常用穴位名称与定位第3部分：小鼠》[12])。参照Chen等[13]的腧穴热敏化标准，艾灸过程根据小鼠尾温是否超过1℃分为热敏灸组(11只)及非热敏灸组(8只),尾温在1℃上下波动的予以排除(2只)。最终每组各纳入8只。具体干预方法及分组见表1。

表1分组及干预方法

1.2.3标本的采集：

将小鼠麻醉，心脏取血后进行灭活除菌，于-80℃保存，依据表1进行分组，用于后续细胞培养。取右侧股骨待测骨密度(bone mineral density, BMD)。

1.2.4骨密度检测：

应用双能X线骨密度仪对小鼠右侧股骨全段BMD进行检测。将标本置于底部平整并装满生理盐水(确保液体将标本完全覆盖)的薄壁塑料容器内静置，30 min后使用双能X线扫描仪，应用小动物软件进行股骨全段的扫描，测定BMD(g/cm2)。

1.3细胞实验

1.3.1 RAW264.7细胞系体外诱导破骨细胞：

将RAW264.7细胞进行复苏培养和传代，待细胞密度达到80%～90%时，以1.5×104/孔的密度均匀地接种到含有12孔的培养板中，用完全培养基(其中含10%的胎牛血清和200 ng/mL的RANKL)进行诱导培养，第6天行TRAP染色以鉴定破骨细胞。

1.3.2血清干预：

根据表1中细胞分组方案，使用不完全培养基(其中含200 ng/mL的RANKL)进行培养。同时，每组中加入10%实验组血清，设置3个复孔，每隔2 d换液一次。观察细胞形态，培养6 d后进行后续相关检测。

1.3.3 TRAP染色：

细胞固定后行TRAP染色，向每孔中滴加TRAP孵育液，将其放入37℃的温箱中浸染45～60 min,再使用甲基绿染色液进行染色2～3 min,最后经水洗和晾干后镜检。OC胞浆染色后呈紫红色，同时核被甲基绿染成绿色且核超过3个。每孔随机选取3个不相邻视野求均值，计数每组OC数。

1.3.4实时荧光定量PCR(qPCR)检测组织蛋白酶K(CTSK)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的mRNA相对表达量：

使用超纯RNA提取试剂盒提取细胞总RNA,变性后逆转录合成cDNA,根据荧光PCR仪说明对cDNA进行扩增。引物序列见表2。

表2目标基因引物序列

1.3.5蛋白免疫印迹法(Western blot)检测PI3K/AKT/mTOR相关蛋白的表达：

提取细胞蛋白，确定浓度后行上样电泳，分别加入p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、β-actin抗体孵育过夜，洗膜后加入二抗孵育2 h。最后进行显影成像，以β-actin为内参对照进行条带数据标准化，使用Image J V1.8.0软件进行分析。

1.4统计学分析

使用SPSS 26.0软件对数据进行整理分析。符合正态分布结果以均值±标准差来表示，采用单因素方差分析(ANOVA)和LSD多重比较分析数据。根据显著性水平，P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1小鼠的一般情况

干预8周后，观察小鼠精神状态、灵活性、皮毛等一般情况，发现假手术组小鼠反应灵敏、皮毛光顺；模型组小鼠行动迟缓，毛发粗糙无光泽；雌激素组、热敏灸组、非热敏灸组小鼠反应略顿，皮毛欠光亮，偶有毛糙，其中雌激素组小鼠状态最佳，热敏灸组次之。

2.2热敏灸对OP小鼠BMD的影响

与假手术组相比，模型组小鼠股骨BMD显著降低(P<0.05);而与模型组相比，雌激素组、热敏灸组和非热敏灸组中小鼠股骨BMD均显著增加(P<0.05)。组间比较发现，热敏灸组小鼠股骨BMD增加程度较雌激素组显著降低，但较非热敏灸组显著升高(P<0.05)。见表3。

注：与假手术比较，*P<0.05;与模型组比较，#P<0.05;与热敏灸组比较，▲P<0.05;与空白血清组比较，*P<0.05;与模型血清组比较，#P<0.05;与热敏灸血清组比较，▲P<0.05。

表3各组小鼠骨密度及破骨细胞数量比较(±s,n=8)

2.3热敏灸对RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响

观察各实验组RAW264.7细胞均可分化为含数个细胞核的多核细胞。模型血清组OC数较其他组显著增多(P<0.05),且OC内细胞核数明显增多。雌激素血清组、热敏灸血清组及非热敏灸血清组OC数量逐次升高。TRAP染色结果见图1(箭头指向破骨细胞),每组破骨细胞数量见表3。

图1各组TRAP染色(倒置显微镜下观察，×100)

2.4热敏灸对组织蛋白酶K(CTSK)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)破骨细胞标志基因的影响

与空白血清组比较，模型血清组的CTSK和MMP-9基因表达显著增加(P<0.05)。而与模型血清组相比，雌激素血清组、热敏灸血清组、非热敏灸血清组的CTSK和MMP-9转录水平均显著下降(P<0.05)。见图2。

2.5热敏灸对破骨细胞内PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白的影响

与空白血清组比较，模型血清组OC中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白高表达(P<0.05),而与模型血清组比较，雌激素血清组、热敏灸血清组、非热敏灸血清组OC中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平下调(P<0.05)。见图3。

3、讨论

OP在传统医学中可归属“骨痿”“骨痹”类，其病位在骨，肾虚为发病之本[14]。《丹溪心法》有言：“肾虚受之，腿膝枯细，骨节酸疼，精走髓空”。骨痛为其主要症状，常局限于腰背、髋、膝及腕关节等部位，甚者延伸至全身，伴腰膝酸软，易发生脆性骨折[15]。中医治疗OP不外乎以补肾为大法。肾俞穴为热敏化高发腧穴，OP患者肾俞穴附近较易产生腧穴敏化现象[16],且肾俞穴为肾之背俞穴，乃肾之脏气所输，有培肾壮骨之功，配以热敏灸温阳之性，以达温肾助阳，强筋壮骨之效，为治疗OP常用选穴之一[17]。研究显示[1],灸法可以通过调节内分泌、免疫系统，抑制OC活性并促进OB的生成[19],进而有效改善OP。本研究发现，模型组小鼠股骨BMD较假手术组显著下降，提示模型制备成功。热敏灸组、非热敏灸组小鼠股骨BMD较模型组显著升高，且小鼠的精神状态和反应速度均有所改善，其中热敏灸组更有优势，阐明了热敏灸“肾俞穴”可以改善去势小鼠BMD下降的情况，对去势小鼠OP有确切疗效。

图2各组破骨细胞标志基因CTSK、MMP-9表达

图3各组破骨细胞PI3K/AKT/mTOR通路中相关蛋白表达

RAW264.7细胞是目前公认的破骨前体细胞，经RANKL诱导后，可分化为成熟的OC[20],同时激活OC特异性基因，如CTSK和MMP-9等[21]。本实验使用RANKL体外诱导RAW264.7细胞，并用不同组血清进行干预，发现模型血清组中OC数量显著增多，且这些OC内细胞核数较其他组明显增多，CTSK、MMP-P基因高表达，提示OP小鼠血清可增加CTSK、MMP-9的表达，促进RAW264.7细胞向OC的分化，而经热敏灸干预的小鼠血清可以抑制这一过程。

PI3K/AKT/mTOR信号通路是调节OP的重要信号通路之一[22],选择性地影响OB和OC的生理功能[23],在骨稳态的复杂调控中起着关键作用。PI3K是一种细胞内磷脂酰肌醇激酶，在特定条件下被激活后能够启动自磷酸化，其活化形式与下游靶蛋白AKT结合，通过磷酸化过程激活AKT[24]。而激活的AKT可被转位到细胞质或细胞核，进一步调控下游信号分子mTOR,从而激活PI3K/AKT/mTOR信号通路[25]。研究表明[26],p-PI3K、p-AKT和p-mTOR在OP大鼠中表达上调，提示这些信号分子在OP的发病机制中发挥作用。而调节PI3K/AKT/mTOR通路，可促进OB增殖和分化[27],同时抑制OC分化的过程[28],发挥抗OP作用。本研究探知，模型血清组OC中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达显著提高，而雌激素组、热敏灸组和非热敏灸组血清均可抑制其表达。本实验结果证实了OP小鼠血清可以显著提高OC中PI3K、AKT、mTOR磷酸化水平，而经过热敏灸干预后的小鼠血清显著抑制OC中PI3K/AKT/mTOR信号通路的磷酸化过程，与上述观点相符。

综上所述，热敏灸对OP小鼠股骨BMD有明显的改善作用。这种作用可能是通过调控OC中PI3K/AKT/mTOR信号通路，继而抑制OC分化实现的。然而，热敏灸对OP治疗机制十分复杂，虽然破骨细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路被认为是一种潜在的有效干预途径，但仍需更多的研究来证明这种干预途径对骨组织中OB、骨细胞等其他细胞的影响。

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基金资助:江西省中医药管理局科技计划重点项目(2021Z009);

文章来源:滕子忻,欧阳建江,陈煌,等.热敏灸对骨质疏松小鼠破骨细胞PI3K/AKT/mTOR通路的影响[J].中国骨质疏松杂志,2024,30(07):964-969.